|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
|
Virulence of Bordetella pertussis from an Omics Perspective
Novák, Jakub ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Gram-negativní aerobní kokobacilus Bordetella pertussis je jedním z nemnoha výhradně lidských patogenů a hlavním původcem respiračního onemocnění zvaného pertuse, nebo také černý kašel. Navzdory globálním vakcinačním programům představuje pertuse stále významný problém pro veřejné zdraví - ročně padne za oběť tomuto onemocnění po celém světě na sto tisíc dětí a celkové počty hlášených případů dosahují desítek milionů. Také proto je výzkumu mechanismů působení faktorů virulence bakterie B. pertussis věnována významná pozornost. Navzdory tomu však zůstává biologie interakcí této bakterie se svým lidským hostitelem z velké části neznámá nebo jen málo prozkoumaná. Evoluce, genetika a adaptace B. pertussis komplexnímu prostředí lidského nosohltanu spolu s procesy umožňujícími této bakterii obejít hostitelské obranné mechanismy, ať už vrozené, tak i získané imunity, jsou doposud jen částečně popsány a pochopeny. V tomto kontextu představují omics přístupy velmi cenné nástroje k odhalení doposud neznámých aspektů interakcí mezi hostitelem a patogenem a otevírají tak cestu detailnější analýze regulace virulence pomocí mechanistických studií. V této práci představuji výsledky tří omics projektů věnovaných biologii B. pertussis, postavených alespoň zčásti na tzv. high-throughput proteomických přístupech. V...
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Role segmentu 400-500 v biologické aktivitě adenylát cyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis
Suková, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát cyklázový toxin-hemolyzin (CyaA) je RTX protein, který hraje zásadní roli ve virulenci bakterie Bordetella pertussis, způsobující onemocnění černý kašel. CyaA dopravuje do cytosolu CD11b+ fagocytů svou enzymatickou adenylát cyklázovou doménu a katalyzuje přeměnu ATP na cAMP, které následně zablokuje baktericidní funkce fagocytů. Současně toxin vytváří v membráně cílových buněk póry, způsobující únik draselných iontů z buňky. Cílem této diplomové práce bylo analyzovat mechanizmus interakce domény spojující invazivní adenylát cyklázovou (AC) doménu a tzv. RTX hemolyzin s biologickou membránou. Z našich výsledků vyplývá, že tato doména interaguje s cílovou membránou a hraje zásadní roli v tvorbě malých pórů selektivních pro kationty. Získané výsledky budou zásadní pro pochopení interakce bakteriálních toxinů s cílovou membránou a naleznou reálné použití při vývoji terapeutických vakcín odvozených od CyaA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, adenylát cyklázový toxin, translokace přes membránu, pórotvorná aktivita, černé lidipové membrány, liposomy
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Dráber, Petr (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS)
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů - ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle.
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
host ::
RSS.