|
|
Interakce polyomavirů s proteazomálním systémem hostitelských buněk
Verdánová, Martina ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Horák, Martin (oponent)
Interakce polyomavirů s proteazomálním systémem hostitelských buněk Abstrakt: Virová čeleď Polyomaviridae obsahuje mimo modelových virů - myšího polyomaviru a viru SV40 také lidské patogeny, mezi něž patří i virus BK. Polyomaviry jsou malé viry, jejichž kapsida není obalená a jako genom nesou dvouřetězcovou molekulu DNA. Porozumění jejich životnímu cyklu je nezbytné pro jejich využití v genové terapii nebo imunoterapii stejně jako pro prevenci či léčbu jimi způsobených komplikací. Tato diplomová práce je zaměřena na studium časné fáze infekce MPyV a viru SV40, tedy hlavně na dopravu virového genomu do jádra a roli proteazomálního systému hostitelských buněk v této fázi. Bylo zjištěno, že blokace proteazómů specifickým inhibitorem vede ke zvýšení exprese časného nestrukturního proteinu LT, který byl zvolen jako marker vstupu viru do jádra a úspěšné virové exprese. Sledování vzájemné lokalizace proteazómů a proteinu VP1 MPyV a viru SV40 ukázalo 10% kolokalizaci zmíněných struktur. Dále bylo zjištěno, že proteazomální inhibitor MG-132 zásadním způsobem negativně ovlivňuje replikaci DNA, a to jak virové tak buněčné. Dalším cílem této práce bylo připravit antigen - unikátní část proteinu VP2 BK viru - na výrobu protilátky. Nejprve byl vytvořen expresní vektor s vloženým DNA fragmentem unikátní části VP2 BKV, za...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru
Vít, Ondřej ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní Nkoncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým alfa-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní...
|
|
|
Vliv posttranslačních modifikací minoritních proteinů a acetylace mikrotubulů na průběh infekce myším polyomavirem
Mariničová, Zuzana ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virion myšího polyomaviru (MPyV) je složen z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3. Minoritní proteiny nejsou nutné pro sestavení kapsidy, jsou ale klíčové pro infektivita virových částic. Tato práce se v první části zabývá modifikacemi VP2 a VP3, deamidací Asn na pozici 253 VP2 (137 VP3) a N-koncovou acetylací Ala VP3, které by mohly být důvodem dvojitých proužků VP2 a VP3 na SDS- PAGE. V minulosti byly připraveny mutantní genomy MPyV N253D (Asn nahrazen Asp) a N253E (Asn nahrazen Glu) simulující deamidaci a A117V (Ala nahrazen Val) se sníženou acetylací. Připravili jsme mutantní viry ve třech izolacích a potvrdili jsme, že deamidace je příčinou dvojitých proužků. Mutantní viry byly porovnány s divokým typem z hlediska efektivity infekce, vliv deamidace se ale nepodařilo prokázat. Virus s mutací A117V je neinfekční, důvodem může být snížení acetylace nebo aminokyselina na této pozici. Dále se tato práce zabývá vlivem acetylace -tubulinu na průběh infekce MPyV. Acetylace - tubulinu je studována z hlediska virové infekce z důvodu vývoje nových antivirových strategií. Po infekci MPyV se acetylace zvyšuje, není to ale důsledek změny exprese mRNA acetylačního (TAT1) nebo deacetylačního enzymu tubulinu (HDAC6). Inhibice HDAC6 pomocí tubacinu, specifického...
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Studium vlastností minoritních strukturních proteinů myšího polyomaviru
Bílková, Eva ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je jedním z modelových zástupců čeledi Polyomaviridae. Kapsida MPyV se skládá z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních proteinů VP2 a VP3. Minoritní kapsidové proteiny pravděpodobně napomáhají přesunu virového genomu přes membránu endoplasmatického retikula na cestě do jádra v časné fázi infekce. Přesný mechanismus však není znám. Pro studium interakce proteinů VP2 a VP3 MPyV s membránou byly v minulosti vytvořeny expresní plasmidy, kódující mutované VP2 nebo VP3 fúzované s EGFP. Tyto proteiny mají delece v předpokládaných hydrofobních doménách. V této práci byla sledována lokalizace mutovaných proteinů v buňkách. Ukázalo se, že pro asociaci VP2 a VP3 s membránou je nejdůležitější hydrofobní doména 2, zatímco domény 1 a 3 jsou spíše postradatelné. Studium VP2 a VP3 pokračovalo dále analýzou charakteru jejich isoforem. Byly separovány isoformy obou proteinů o různé elektroforetické mobilitě pomocí SDS-PAGE. Následná analýza hmotnostní spektrometrií ukázala, že tyto isoformy se liší v důsledku deamidace na asparaginu společném oběma proteinům (pozice 253 pro VP2 a 137 pro VP3). V minulosti byla také identifikována acetylace N-koncového alaninu VP3. Pro studium funkce nalezených modifikací byly vytvořeny mutované viry se substitucemi těchto aminokyselin. Pilotní...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Preparation of Monoclonal Antibodies Against VP2 Protein of Human Polyomaviruses
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Růžičková, Šárka (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit dva proteinové antigeny a dvě monoklonální protilátky, založené na minoritním proteinu VP2 lidských polyomavirů BK viru a Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Proběhla příprava monoklonální protilátky proti unikátní části proteinu VP2 BK viru (N-koncový epitop, který se nenachází u proteinu VP3). Buněčná linie produkující protilátku s touto specificitou nebyla zatím nikdy ustavena kvůli nízké imunogenicitě tohoto epitopu. Náš přístup byl z hlediska imunizace myší úspěšný, ale později v průběhu přípravy nastaly vážné problémy se stabilitou hybridomové linie. Dalším cílem této práce byla příprava monoklonální protilátky cílené na sekvenci proteinu VP2 Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk. Imunizace myší a hybridomová fúze byly provedeny úspěšně. Po čtyřech kolech klonování za účelem přípravy ustaveného klonu bylo devět klonů vybráno k rozpěstování. Rozpěstování pravděpodobně vedlo ke snížení specificity protilátky a ke ztrátě produkce u většiny hybridomů. Jednou zopakované klonování by mělo vyústit v získání ustaveného klonu s dostatečnou produkcí. Příprava dvou proteinových antigenů byla provedena ve dvou expresních systémech. DNA kódující VP2 protein BK viru zkrácený na C-konci a fúzovaný s His-tagem byla klonována do vektoru vhodného pro expresi v...
|
|
|
Interakce polyomavirů s proteazomálním systémem hostitelských buněk
Verdánová, Martina ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Horák, Martin (oponent)
Interakce polyomavirů s proteazomálním systémem hostitelských buněk Abstrakt: Virová čeleď Polyomaviridae obsahuje mimo modelových virů - myšího polyomaviru a viru SV40 také lidské patogeny, mezi něž patří i virus BK. Polyomaviry jsou malé viry, jejichž kapsida není obalená a jako genom nesou dvouřetězcovou molekulu DNA. Porozumění jejich životnímu cyklu je nezbytné pro jejich využití v genové terapii nebo imunoterapii stejně jako pro prevenci či léčbu jimi způsobených komplikací. Tato diplomová práce je zaměřena na studium časné fáze infekce MPyV a viru SV40, tedy hlavně na dopravu virového genomu do jádra a roli proteazomálního systému hostitelských buněk v této fázi. Bylo zjištěno, že blokace proteazómů specifickým inhibitorem vede ke zvýšení exprese časného nestrukturního proteinu LT, který byl zvolen jako marker vstupu viru do jádra a úspěšné virové exprese. Sledování vzájemné lokalizace proteazómů a proteinu VP1 MPyV a viru SV40 ukázalo 10% kolokalizaci zmíněných struktur. Dále bylo zjištěno, že proteazomální inhibitor MG-132 zásadním způsobem negativně ovlivňuje replikaci DNA, a to jak virové tak buněčné. Dalším cílem této práce bylo připravit antigen - unikátní část proteinu VP2 BK viru - na výrobu protilátky. Nejprve byl vytvořen expresní vektor s vloženým DNA fragmentem unikátní části VP2 BKV, za...
|
host ::
RSS.