|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
Léčiva a možnost jejich eliminace z odpadních vod
Křivánková, Zuzana ; Repková, Martina (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce se věnuje problematice vlivu rostoucí spotřeby léčiv na složky životního prostředí. V České republice jsou v současnosti stále více předepisována a pacienty užívána léčiva na bázi benzodiazepinových derivátů. Sledovanými zástupci byly v této studii alprazolam, bromazepam, diazepam a oxazepam, jejichž indikacemi jsou poruchy spánku, psychiatrická onemocnění, avšak také celková anestezie nebo léčba epilepsie. Přítomnost těchto léčiv bývá opakovaně potvrzována v odpadních a povrchových vodách na celém území Evropy a jiných vyspělých zemí, ačkoliv jsou známy jejich negativní účinky na vodní ekosystém. Cílem této práce je optimalizace metod pro stanovení zvolených léčiv v odpadních vodách odebraných v Brně a okolí. Rovněž byla vyhodnocena rizika pro vodní ekosystém související s přítomností léčiv v cílových matricích, kterými byly odpadní vody z čistíren odpadních vod (ČOV) Brno – Modřice a ze dvou dalších obcí z Jihomoravského kraje. Byly sledovány koncentrace léčiv na přítoku a na odtoku. Analyty byly z matric izolovány pomocí extrakce tuhou fází (SPE) a kvantifikovány ultraúčinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC) s detekcí pomocí diodového pole (DAD).
|
|
|
Analýza a izolace intermediátů biosyntetické dráhy alkylprolinových derivátů
Cudlman, Lukáš ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Michalíková, Klára (oponent)
(CZ) Tato diplomová práce je zaměřena na přípravu, analýzu a izolaci intermediátů biosyntetické dráhy 4-alkyl-L-prolinových derivátů pro jejich strukturní identifikaci. Mezi sloučeniny obsahující inkorporované 4-alkyl-L-prolinové deriváty patří klinicky používané antibiotikum, linkomycin A, ze skupiny linkosamidů, dále některé pyrrolobenzodiazepiny s protinádorovými účinky a bakteriální hormon hormaomycin. Studiem intermediátů biosyntetických drah těchto biologicky aktivních sloučenin je možné získat poznatky, které mohou být využity při přípravě nových a účinnějších derivátů biologicky aktivních metabolitů. První část diplomové práce se zaměřuje na žlutě zabarvené dikarboxylové intermediáty 1 a 2 biosyntetické dráhy 4-propyl-L-prolinu - prekursoru linkomycinu A. V přítomnosti methylačního činidla S-adenosyl-L-methioninu a C-methyltransferasy LmbW se podařilo částečně přeměnit intermediát 1 na intermediát 2. Obě sloučeniny byly identifikovány pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie z absorpčních i hmotnostně-spektrometrických spekter. Byla vyvinuta semi- -preparativní chromatografická metoda pro izolaci obou intermediátů. Neočekávaně byla zjištěna výrazně nižší stabilita intermediátu 2 ve srovnání s intermediátem 1 v in vitro enzymatické reakční směsi. Druhá část diplomové práce se...
|
|
|
Vývoj a optimalizace SPE metody pro prekoncentraci a stanovení fluorotelomerních alkoholů ve vodách
Ševčík, Václav ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent)
V této práci byla vyvinuta a pokročilými statistickými metodami optimalizována GC metoda s hmotnostní detekcí a SPE prekoncentračním krokem pro stanovení fluorotelomerních alkoholů ve vodných vzorcích. Jako analyty byly zvoleny 1H,1H,2H,2H- perfluoro-1-oktanol (6:2 FTOH) a 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-dekanol (8:2 FTOH). V průběhu optimalizace metody pro GC byl současně testován vliv faktorů, jako je objem vzorku, tlak nosného plynu, počáteční teplota analýzy, čas dávkování vzorku a teplota injektoru na velikost odezvy. Pomocí statistického programu Minitab 16 a série měření byla nalezena optima významných faktorů a vhodný druh ionizace pro oba analyty. Limity detekce GC-MS metody jsou 0,24 ng/mL pro 6:2 FTOH a 0,42 ng/mL pro 8:2 FTOH. Pro SPE prekoncentraci byly testovány faktory jako druh kondicionačního činidla a jeho objem, rychlost kondicionace, rychlost průtoku vzorku, způsob sušení kolony, druh elučního činidla a jeho objem. Pomocí programu Minitab 16 byly určeny optimální hodnoty těchto faktorů. Sledováním závislosti výtěžku extrakce SPE na objemu a koncentraci zásobního roztoku bylo pro stanovení fluorotelomerních alkoholů za daných experimentálních podmínek určeno omezení maximálního objemu vzorku (400 mL) a minimální koncentrace roztoku (100 pg/mL).
|
|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
Analýza a izolace intermediátů biosyntetické dráhy alkylprolinových derivátů
Cudlman, Lukáš ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Michalíková, Klára (oponent)
(CZ) Tato diplomová práce je zaměřena na přípravu, analýzu a izolaci intermediátů biosyntetické dráhy 4-alkyl-L-prolinových derivátů pro jejich strukturní identifikaci. Mezi sloučeniny obsahující inkorporované 4-alkyl-L-prolinové deriváty patří klinicky používané antibiotikum, linkomycin A, ze skupiny linkosamidů, dále některé pyrrolobenzodiazepiny s protinádorovými účinky a bakteriální hormon hormaomycin. Studiem intermediátů biosyntetických drah těchto biologicky aktivních sloučenin je možné získat poznatky, které mohou být využity při přípravě nových a účinnějších derivátů biologicky aktivních metabolitů. První část diplomové práce se zaměřuje na žlutě zabarvené dikarboxylové intermediáty 1 a 2 biosyntetické dráhy 4-propyl-L-prolinu - prekursoru linkomycinu A. V přítomnosti methylačního činidla S-adenosyl-L-methioninu a C-methyltransferasy LmbW se podařilo částečně přeměnit intermediát 1 na intermediát 2. Obě sloučeniny byly identifikovány pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie z absorpčních i hmotnostně-spektrometrických spekter. Byla vyvinuta semi- -preparativní chromatografická metoda pro izolaci obou intermediátů. Neočekávaně byla zjištěna výrazně nižší stabilita intermediátu 2 ve srovnání s intermediátem 1 v in vitro enzymatické reakční směsi. Druhá část diplomové práce se...
|
|
|
Biodegradace polychlorovaných bifenylů v podzemní vodě pomocí biologických přístupů
Šrédlová, Kamila ; Cajthaml, Tomáš (vedoucí práce) ; Innemanová, Petra (oponent)
Polychlorované bifenyly (PCB) jsou významné organické polutanty, které velmi pomalu podléhají degradaci a dlouhou dobu přetrvávají v životním prostředí. PCB mají mnohé negativní účinky na životní prostředí, organismy i lidské zdraví. Pro stanovení PCB ve vodných matricích byla optimalizována metoda extrakce pevnou fází (SPE) s následnou analýzou prostřednictvím GC/MS. Průměrná výtěžnost SPE demineralizované vody uměle kontaminované PCB se pro jednotlivé kongenery pohybovala kolem 85 %. V dlouhodobě kontaminované podzemní vodě pocházející z areálu bývalé obalovny živičných drtí byla zjištěna koncentrace PCB 3,3 ± 0,1 μg·l-1 (suma vybraných kongenerů). Nejhojněji zastoupené kongenery byly trichlorované PCB, které dohromady představovaly asi 80 % celkového obsahu PCB. Vytvořená metodika byla dále spolu s vysokotlakou extrakcí pevných matric (ASE) použita pro zhodnocení degradačního potenciálu hlívy ústřičné (Pleurotus ostreatus), u které byla v literatuře popsána vysoká degradační účinnost vůči některým organopolutantům, včetně některých kongenerů PCB. P. ostreatus patří mezi ligninolytické houby (houby bílé hniloby), perspektivní skupinu mikroorganismů hojně studovanou z hlediska bioremediačních aplikací. P. ostreatus KRYOS byl při degradaci komerční směsi PCB Deloru 103 schopen z počátečního obsahu...
|
|
|
Léčiva a možnost jejich eliminace z odpadních vod
Křivánková, Zuzana ; Repková, Martina (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce se věnuje problematice vlivu rostoucí spotřeby léčiv na složky životního prostředí. V České republice jsou v současnosti stále více předepisována a pacienty užívána léčiva na bázi benzodiazepinových derivátů. Sledovanými zástupci byly v této studii alprazolam, bromazepam, diazepam a oxazepam, jejichž indikacemi jsou poruchy spánku, psychiatrická onemocnění, avšak také celková anestezie nebo léčba epilepsie. Přítomnost těchto léčiv bývá opakovaně potvrzována v odpadních a povrchových vodách na celém území Evropy a jiných vyspělých zemí, ačkoliv jsou známy jejich negativní účinky na vodní ekosystém. Cílem této práce je optimalizace metod pro stanovení zvolených léčiv v odpadních vodách odebraných v Brně a okolí. Rovněž byla vyhodnocena rizika pro vodní ekosystém související s přítomností léčiv v cílových matricích, kterými byly odpadní vody z čistíren odpadních vod (ČOV) Brno – Modřice a ze dvou dalších obcí z Jihomoravského kraje. Byly sledovány koncentrace léčiv na přítoku a na odtoku. Analyty byly z matric izolovány pomocí extrakce tuhou fází (SPE) a kvantifikovány ultraúčinnou kapalinovou chromatografií (UHPLC) s detekcí pomocí diodového pole (DAD).
|
host ::
RSS.