|
| |
|
|
Molekulární diagnostika fungálních patogenů z klinických vzorků
CIMICKÁ, Jana
Tato studie je zaměřena na optimalizaci a použití molekulárních metod v mykologické diagnostice. Pacientův život často závisí na včasné diagnostice, kterou běžné kultivační metody nemohou poskytnout. Řešením jsou pan-fungální primery ITS oblasti a sekvenování nové generace (NGS). Tyto metody byly použity pro fungální detekci z FFPE vzorků tkání od pacientů s ulcerózní kolitidou (UK), Crohnovou chorobou (CD) a 10 kontrol bez chronických zánětlivých změn ve střevní sliznici. Výsledky této studie mají tři úrovně. Za prvé, proces optimalizace upozornil na důležitost sterilní izolace DNA v laminárním boxu, který může zabránit kontaminaci fungálním rodem Malassezia spp. Za druhé, hrubá data ukázala vyvážený poměr Askomycet a Basidiomycet u CD vzorků podobný poměrům v negativních kontrolách, zatímco UC vzorky ukázaly vyšší zastoupení Askomycet oproti ostatním skupinám. Za třetí, podrobná data zobrazila fungální rody Malassezia, Cladosporium a Toninia ve všech skupinách vzorků, zatímco rod Candida byl nalezen jen v UC vzorcích a rody Engyodontium a Ramularia byly nalezeny v CD vzrocích. Závěrem, mykobiom hraje roli v idiopatických střevních onemocněních; ačkoliv jeho složení je stále diskutabilní. Optimalizace pan-fungální nested PCR a NGS pomohla se zavedením mykologické diagnostiky z FFPE vzorků v Bioptické laboratoři s.r.o. a nyní se používá pro diferenciální diagnostiku.
|
|
|
Virom dolních močových cest
Cirbusová, Adéla ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Lidský močový trakt byl dlouhou dobu pokládán za sterilní prostředí. V posledních letech se však ukázalo, že je osídlen rozmanitou mikrobiální komunitou, jejíž součástí jsou i viry. O viromu moči je toho ale prozatím známo jen velmi málo. V této práci byl virom močového traktu charakterizován u tří jedinců ze vzorků moči pomocí metodiky sekvenování nové generace (NGS), jež byla nejprve pro tento účel optimalizována. Charakteristika viromu ze vzorků moči pomocí NGS se však ukázala být poměrně problematická, což bylo zapříčiněno především fragmentací virových genomů. I přes to se podařilo u všech tří jedinců identifikovat lidské endogenní retroviry a u dvou z nich také JC polyomavirus. Složka viromu moči tvořená lidskými DNA viry byla dále blíže prozkoumána pomocí kvantitativní PCR. Možný rozdíl v zastoupení a virové náloži lidských DNA virů byl pozorován u pacientů s karcinomem močového měchýře (mm) a bez karcinomu mm a také v závislosti na části močového traktu, ze které byl vzorek odebrán. Nejvíce zastoupené viry byly Torque Teno virus a JC polyomavirus. Torque Teno virus byl detekován u 75 % pacientů s karcinomem mm a 60 % pacientů bez karcinomu, JC polyomavirus u 43,8 % pacientů s karcinomem mm a 50 % pacientů bez karcinomu. U 25 % pacientů s karcinomem mm a 20 % pacientů bez karcinomu se dále...
|
|
|
Molekulární identifikace, typizace a adaptace Achromobacter spp. v průběhu chronické infekce
Učíková, Barbora ; Dřevínek, Pavel (vedoucí práce) ; Nemec, Alexandr (oponent)
Achromobacter spp. je nově se objevující patogen zejména chronických respiračních infekcí u pacientů s cystickou fibrózou. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF poskytuje spolehlivou identifikaci pouze na úrovni rodu. Pro druhovou identifikaci zástupců se používá sekvence genu nrdA. Studiem klonality s využitím multilokusové sekvenční typizace lze zjistit, zda je pacient infikován stále stejným klonem, nebo zda postupem času dochází k reinfekci novým kmenem. Do naší studie byly zařazeny časosběrné izoláty Achromobacter spp. od pacientů s cystickou fibrózou. Pacienti byly rozděleni do tří skupin, podle časového intervalu mezi odběry. U první skupiny činil vnější interval mezi odběry cca 10 let, u druhé 7 až 12 měsíců a zbývající skupinu tvořily samostatné izoláty. V průběhu chronické infekce dochází k adaptaci Achromobacter spp. na exponující antibiotika i na hostitele. Izoláty odebrané v intervalu deseti let vykazovaly vyšší počet mutací než izoláty s intervalem odběrů do jednoho roku. V průběhu chronické infekce dochází ke ztrátě motility, což jsme prokázali fenotypově na úrovni motility, snížení počtu bičíků i změny v genech pro tvorbu bičíků. U některých izolátů bylo zaznamenáno zvýšení rezistence screeningovou diskovou difúzní metodou. Vzhledem ke stále častější izolaci Achromobacter spp. z...
|
|
| |
|
|
Rozdíly ve viromu včel u různých populací včely medonosné (Apis mellifera)
Kadlečková, Dominika ; Tachezy, Ruth (vedoucí práce) ; Votýpka, Jan (oponent)
Včela medonosná (Apis mellifera), hlavní komerční opylovač, má nezastupitelnou roli v zemědělské produkci. U A. mellifera bylo do dnes objeveno velké množství virů, o řadě z nich zatím není známo, zda jsou pro tento druh opylovačů patogenní. U jiných se ukazuje, že koinfekce s jinými patogeny, jako je Varroa destructor, mohou mít pro tento druh fatální následky. Cílem této studie bylo jednak ověřit robustnost metody vypracované v laboratoři pro detekci viromu včel a charakterizovat složení viromu u různých skupin zdravých včelstev v České republice. V neposlední řadě i analyzovat parazitaci včel dalšími patogeny a korelovat jejich přítomnost s detekovanými viry. V této studii bylo identifikováno velké množství virových sekvencí pocházejících z nejrůznějších čeledí. Celkové složení viromu bylo nejvíce podmíněno včelstvem, ze kterého byly včely získány. Velkou váhu na tomto vztahu hrály přítomné bakteriofágy. Oproti tomu analýza jednotlivých virů, u kterých je známo že infikují včelu, naznačila, že u jednotlivců ve včelstvu bude prevalence a virová nálož různých virů odlišná. To vyvrátilo předpoklad, že při přítomnosti virové nákazy je infikovaná většina jedinců v úle. Byla také nalezena velká diverzita Lake Sinai virů. Mezi některými viry bylo možné pozorovat závislosti, buď na přítomnost jiného...
|
|
| |
|
|
Přínos Next Generation Sequencing pro laboratorní diagnostiku
Votýpka, Pavel ; Beránek, Martin (vedoucí práce) ; Macháček, Miloslav (oponent)
4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Pavel Votýpka Školitel: Doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Konzultant: Mgr. Nikola Ptáková Název diplomové práce: Přínos Next Generation Sequencing pro laboratorní diagnostiku Snaha o přečtení lidského genomu ve svém důsledku vedla nejen k získání poznatků o lidské genetické informaci, ale také k vývoji nových sekvenačních metod a technologií. Pro udržení kroku s rozvojem v oblasti genetiky se na řadě klinických i výzkumných pracovišť do běžného provozu zavádějí přístroje druhé generace na principu masivního paralelního sekvenování. Na trhu dnes dominují čtyři platformy - Illumina, Solid, Ion Torrent a 454 Life Technologies. Proces celé sekvenační analýzy lze shrnout do tří hlavních kroků - příprava sekvenační knihovny, sekvenování a detekce nukleotidů a analýza dat. Každá část analýzy přináší v závislosti na použité platformě svá specifika, se kterými je nutné počítat a také úskalí, kterým je vhodné se vyhnout či minimalizovat jejich vliv na finální výsledek analýzy. V posledních několika letech jsou vyvíjeny i nové metody označované jako třetí generace sekvenování, které umožňují čtení jediné molekuly nukleové kyseliny bez její amplifikace. NGS technologie dnes umožňují, aby si každé...
|
|
| |
|
|
Analýza nádorové predispozice a funkční analýza variant nejasného významu
Stolařová, Lenka ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Průměrně 5-10% všech onkologických onemocnění vzniká u pacientů s dědičnými nádory, kteří mohou mít mutace v desítkách až stovkách nádorových predispozičních genů. Fenotypy se u nosičů mutací překrývají, proto je paralelní vyšetření panelů genů metodou volby v diagnostice. V naší laboratoři jsme připravili univerzální panel i panel určený k cílené analýze specifického nádorového onemocnění, které nám umožnily identifikovat genetické alterace u pacientek s karcinomem prsu a ovaria, pacientů s melanomem, a dalšími nádorovými onemocněními v ČR. Výsledky analýz sekvenování nové generace (NGS) ukazují, že nejčastější genetickou příčinou v ČR u karcinomu ovaria jsou dědičné mutace v BRCA1 (u 24% neselektovaných pacientek) a u maligního melanomu CDKN2A (u 2 % rizikových pacientů). Přítomnost dědičných alterací je klinicky významným fenoménem ovlivňujícím prognózu i léčbu onemocnění. Interpretaci nálezů NGS však komplikuje přítomnost variant nejasného významu (VUS). Na interpretaci VUS v hlavních predispozičních genech BRCA1 a BRCA2 se podílíme v rámci mezinárodního konsorcia ENIGMA (Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles). Naše i mezinárodní výsledky nejvíce studované skupiny dědičných nádorových onemocnění - pacientek s karcinomem prsu a ovaria ukazují, že třetím...
|
host ::
RSS.