|
|
Výskyt β-rutinosidasy v eurokaryotických mikroorganismech
Adamcová, Kateřina ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Králová, Blanka (oponent)
Rutinosidy jsou velmi běžné glykosidické prekurzory aromatických látek. Navázané glykosidy ovlivňují aroma vín, chuť džusů atd, hydrolýzou glykosidické vazby je možno zvýšit aroma některých produktů. Jedním z enzymů schopných této hydrolýzy je i β-rutinosidasa produkovaná extracelulárně kmenem Aspergillus niger. Purifikovaná β rutinosidasa byla částečně sekvenována (MALDI-TOF/TOF), výsledek analýzy byl porovnán se sekvencemi v databázích (BLAST). Inzert kódující β-rutinosidasu byl ligován do expresního vektoru pPICZα A. Jako expresní systém byl použit kmen Pichia pastoris KM71H. Bylo zjištěno, že gen pro β rutinosidasu obsahuje 1137 bp kódující protein o 379 aminokyselinách. Elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným byla zjištěna molekulová hmotnost enzymu 60 kDa, deglykosylovaná froma 45 kDa. pH optimum enzymu bylo stanoveno jako 3,0 a teplotní optimum při teplotě 50 řC. Substrátem pro stanovení enzymové aktivity byl p nitrofenyl β rutinosid. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
| |
|
|
Enzymatické modifikace GlcNAc-thiazolinových inhibitorů hexosaminidas
Šmeringaiová, Ingrida ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Tato práce se zabývá problematikou hledání účinných inhibitorů enzymů β-N- acetylhexosaminidas, které jsou odvozeny od 1,2-dideoxy-2'-methyl-α-D-glukopyranoso-[2,1- d]-Δ2'-thiazolinu (NGT). Práce je orientována na produkci inhibitorů odvozených od struktury NGT, acetylací jeho molekuly pomocí volných a na nosičích imobilizovaných lipas. Potenciální inhibitory β-N-acetylhexosaminidas mohou být účinnými nástroji pro studium těchto enzymů v buněčných procesech a taktéž otevírají dveře k nalezení možných terapeutik pro léčbu některých neurodegenerativních chorob, jako např. Alzheimerova nemoc. V práci je věnována pozornost stručné charakterizaci β-N-acetylhexosaminidas, a to hlavně glykosidas ze skupin označovaných GH 20 a GH 84. V experimentech byly konkrétně využity β-N-acetylhexosaminidasy člověka1 a z mikroorganismů Bacteroides thetaiotao-micron, Aspergillus oryzae, Streptomyces plicatus, Talaromyces flavus. Enzymy byly produkované, izolované, purifikované a následně byla otestována jejich aktivita. 6-O-Acetyl-1,2-dideoxy- 2'-methyl-β-D-glukopyranoso-[2,1-d]-Δ2'-thiazolin byl testován jako inhibitor zkoumaných enzymů. Výchozí látka NGT byl připraven modifikovaným postupem podle Knappa2 z 2- acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glukopyra-nosy reakcí s Lawessonovým činidlem. Předmětem další...
|
|
|
Sulfatované metabolity silybinu a jejich interakce se sulfatasami
Ježková, Zuzana ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Bakalářská práce řeší problematiku syntetických sulfatovaných metabolitů silybinu při jejich interakcích se sulfatasami. Silybin je flavonolignan izolovaný ze semen ostropestřce mariánského (Silybum marianum). Sulfáty silybinu (metabolity) nebyly z organismu dosud izolovány a jejich struktura nebyla tudíž přesně určena. V této práci je uveden postup přípravy silybin-7,23-disulfátu, který byl syntetizován z přírodního silybinu. Disulfát silybinu byl izolován a spektrálně charakterizován (NMR, MS). Dále byly změřeny kinetické parametry reakce pNPS se sulfatasou z Helix pomatia: Km = 0,0494 mmol/l a Vmax = 0,0325 mmol/dm3 /min. Podmínky pro práci se sulfatasou z Helix pomatia byly zvoleny v souladu s literaturou. Jedním z hlavních cílů této práce bylo zjistit zda silybin-7,23-disulfát je substrátem či inhibitorem sulfatasy z Helix pomatia. Měřením aktivity sulfatasy z Helix pomatia v přítomnosti různých koncentrací silybin-7,23-disulfátu bylo zjištěno, že disulfát silybinu při koncentraci vyšší než 0,2 mM je silným inhibitorem testované sulfatasy. Dále bylo provedeno několik reakcí kde silybin-7,23-disulfát byl použit ve vhodné koncentraci jako potenciální substrát pro sulfatasu z Helix pomatia. Reakce byly monitorovány metodou HPLC a bylo prokázáno, že sulfatasa z Helix pomatia štěpí...
|
|
|
Izolace a purifikace environmentální DNA z horizontu stavební skrývky: stratifikační studie
Zahradník, Jiří ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Weignerová, Lenka (oponent)
Podle současných poznatků je půda nejbohatším zdrojem mikrobiální biomasy. Klasickými kultivačními metodami je dostupné pouze necelé jedno procento druhů. Půdní metagenomická DNA je souborem veškeré DNA obsažené ve vzorku půdy, včetně DNA z jinak nekultivovatelných mikroorganismů a umožňuje nám zkoumat molekulární aspekty nekultivovatelných mikroorganismů a tedy jinak nedostupných sekvencí nukleových kyselin. Tato práce je zaměřena na charakterizaci a izolaci půdní metagenomické DNA z hlubokého horizontu skrývky, její zhodnocení z hlediska izolace a technik rekombinantní DNA s následnou stratifikační studií. Získané vzorky půdy byly předběžně charakterizovány z hlediska kvality - obsah jílovitých součástí, huminových látek a hrubý počet mikroorganismů. Následně byla isolována půdní metagenomická DNA, která byla kvantitativní a kvalitativní analýzou charakterizována. Byla vyhodnocena použitá metodika, vhodnost izolátu pro další použití a vliv kvalit půdy na proceduru jako takovou. Podle výsledků analýzy byly vybrány DNA izolované ze tří vzorků a zpracovány na knihovnu fragmentů lokusů 16S rRNA na DNA. Vybrané fragmenty byly sekvenovány a zpracovány na fylogenetickou studii, u které byl dán zřetel na měnící se diverzitu mikroorganismů v závislosti na hloubce (stratifikační studie)
|
|
|
Nové možnosti aplikace nittrilas v biokatalýze a bioremediaci
Veselá, Alicja Barbara ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Weignerová, Lenka (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy, jež katalyzují hydrolýzu nitrilů na karboxylové kyseliny. Pro svou chemo- a enantioselektivitu mají tyto enzymy velký potenciál pro využití v biokatalýze, např. při syntéze kyseliny mandlové a mandelamidu, nebo bioremediaci míst kontaminovaných organickými nitrily. V této práci byla studována nitrilasová aktivita rekombinantních kmenů E. coli exprimujících hypotetické fungální nitrilasy z hub Giberella moniliformis a Nectria haematococca mpVI 77-13-4 a schopnost bakterií rodu Rhodococcus a Nocardia hydrolyzovat benzonitrilové herbicidy dichlobenil (2,6-dichlorbenzonitril), ioxynil (3,5-dijod- 4-hydroxybenzonitril) a bromoxynil (3,5-dibrom-4-hydroxybenzonitril). Hypotetické fungální nitrilasy byly exprimovány jako funkční enzymy. Nitrilasa z G. moniliformis vykazovala nejvyšší aktivitu k benzonitrilu (30,9 U/mg proteinu); při kultivaci byla získána aktivita 2560 U/l buněčné suspenze. Preferovaným substrátem enzymu z N. haematococca byl fenylacetonitril (12,3 U/mg prot.), celkem bylo získáno 28050 U/l buněčné suspenze. Nitrilasa z N. haematococca byla schopna hydrolyzovat mandelonitril (5,9 U/mg prot.). Půdní bakterie Rhodococcus rhodochrous PA-34, Nocardia globerula NHB-2 a Rhodococcus sp. NDB 1165 hydrolyzovaly herbicidy ioxynil, bromoxynil a chlorovaný analog 3,5-dichlor-4-...
|
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.