|
| |
|
| |
|
|
Prolylendopeptidasa z klíštěte Ixodes ricinus
Petrvalská, Olívia ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíšťata jsou významnými parazity a vektory patogenů. Na území České republiky je klíště obecné (Ixodes ricinus) nejrozšířenějším druhem, který přenáší lymskou boreliózu a klíšťovou encefalitidu. Proteasy klíšťat jsou potenciální molekulární cíle pro vývoj nových vakcín proti těmto parazitům. Tato práce se zaměřuje na biochemickou analýzu prolylendopeptidasy z klíštěte obecného, která dosud nebyla studována. Prolylendopeptidasa byla detekována v extraktu ze střevní tkáně klíštěte pomocí jednak měření enzymové aktivity a dále vizualizací na elektroforéze SDS-PAGE metodou fluorescenčního afinitního značení. Prolylendopeptidasa se pravděpodobně účastní procesu proteolytického trávení krevních proteinů, protože její specifická aktivita byla nejvyšší ve střevní tkáni a tato aktivita vzrůstala v průběhu procesu sání a zpracování potravy. Biochemická analýza ukázala, že enzymová aktivita prolylendopeptidasy je (1) závislá na volném cysteinovém zbytku v blízkosti aktivního místa, (2) optimální v oblasti pH 8-9, (3) selektivně inhibována peptidovými inhibitory Z-Ala-Pro-CMK a Z-Pro-Pro-CHO. Klíčová slova: prolylendopeptidasa, proteolýza, enzymová aktivita, substrátová specifita, klíště
|
|
| |
|
| |
|
|
Kinetické vlastnosti β-N-acetylhexosaminidasy z rostlin tabáku
Valenta, Robert ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Částečnou purifikací z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.) byla získána β-N- acetylhexosaminidasa o specifické aktivitě 1,72 µmol . min-1 . mg-1 se substrátem p- nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid. Izoelektrická fokusace a nativní elektroforéza odhalila jedinou izoformu enzymu. Byla stanovena relativní molekulová hmotnost gelovou chromatografií (MR 275 000) a nativní elektroforézou (MR 285 000). Dále byl stanoven izoelektrický bod (pI 5,3). Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla stanovena se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid i p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, a dále se substráty N,N'-diacetylchitobiosa, p-nitrofenyl-N,N'- diacetylchitobiosid a N,N',N''-triacetylchitotriosa, pro které byla optimalizována metoda stanovení pomocí kapilární elektroforézy. S jednotlivými substráty bylo stanoveno pH (4,3-5,0) i teplotní optimum (50-55 řC), byl zdokumentován průběh reakce a identifikovány produkty reakcí. Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla nejvyšší se substrátem p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid a nejnižší se substrátem N,N',N''- triacetylchitotriosa (35% při relativním srovnání). Se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid a N,N'-diacetylchitobiosa byla stanovena maximální rychlost reakce a Michaelisova konstanta β-N-...
|
|
| |
|
|
Nové typy magnetických sorbentů pro analýzu fosfoproteinů
Emmerová, Tereza ; Kučerová, Zdenka (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Byla vypracována metoda pro studium fosforylačních míst fosfoproteinů. Tato metoda je založena na separaci fosfopeptidů po proteolytickém štěpení fosfoproteinů na nových IMAC magnetických sorbentech s imobilizovanými kovovými ionty a jejich následné identifikaci hmotnostní spektrometrií (MS). Neporézní hydrofilní poly(2- hydroxyethyl metakrylát-co-glycidyl metakrylátové) magnetické částice připravené disperzní kopolymerací a modifikované iminodioctovou kyselinou obsahující imobilizované Fe(III) nebo Ga(III) ionty byly použity k separaci fosfopeptidů z proteolytických směsí peptidů modelových fosfoproteinů: α-kaseinu a prasečího pepsinu A. Optimalizací adsorpčních a elučních podmínek se nám na připravených magnetických sorbentech podařilo selektivně separovat fosfopeptidy z proteolyticky rozštěpeného modelového fosfoproteinu, který obsahoval velké množství kyselých peptidů (prasečí pepsin A). Získané výsledky prokázaly, že připravené magnetické sorbenty jsou vhodné k separaci fosfopeptidů s jednou fosfátovou skupinou i vícenásobně fosforylovaných peptidů. Fosfopeptidy separované z proteolytických směsí peptidů modelových proteinů byly analyzovány MS na principu MALDI-TOF (matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight). Pro imunochemickou separaci fosfoproteinů byla připravena...
|
|
| |
|
|
Fytohormony produkované askomycetou Leptosphaeria maculans jako efektory ovlivňující signální dráhy rostlin
Krutinová, Hana ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Leptosphaeria maculans je patogenní houba způsobující fómové černání stonků řepky Brassica napus. V rámci této práce bylo zjištěno, že L. maculans produkuje in vitro řadu fytohormonů a dále se soustředila se na auxiny a brassinosteroidy. Z auxinů byla v myceliu nejvíce zastoupena IAA a její oxidační produkt OxIAA. Složení kultivačního media významně ovlivňuje zjištěnou koncentraci IAA. Přítomnost extraktu z rostlin Brassica napus v kultivačním mediu zvyšuje koncentraci IAA. V rostlinách, infikovaných L. maculans, byla zjištěna zvýšená koncentrace OxIAA oproti kontrolním rostlinám ošetřeným vodou. Byly zjištěny významné odlišnosti v produkci IAA mezi dvěma použitými sesterskými izoláty JN2 a JN3. V chemicky definovaném mediu Gamborg JN2 neprodukuje téměř žádnou IAA, JN3 produkuje IAA v koncentraci asi 1000 pmol/g čerstvé hmotnosti. Tato odlišnost byla využita jako model pro studium exprese genů biosyntetické dráhy auxinů v L. maculans. Tyto geny byly nalezeny na základě homologie s geny Arabidopsis thaliana (YUCCA1.1 a NIT1.2) a Ustilago maydis (IAD1.2 a TAM1-2.1). Pomocí ošetření prekurzory IAA (tryptofan a tryptamin) byla v izolátu JN2 pozorována zvýšená transkripce kandidátních genů biosyntézy auxinů. Po ošetření JN2 kultury tryptofanem a tryptaminem se zvýšila produkce IAA. U JN3 nebyla...
|
host ::
RSS.