|
|
Harnessing soluble forms of NK cell receptors and their ligands for cancer immunotherapy
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky, také NK buňky (z angl. natural killer cells, NK cells) jsou skupinou lymfocytů s přirozenou schopností zabíjet infikované, poškozené nebo maligně transformované buňky. Jelikož jsou tyto lymfocyty součástí přirozené imunity, jsou cytotoxické mechanismy aktivovány po rozpoznání specifických buněčných znaků, avšak bez předchozího kontaktu s antigenem. Toto rozpoznání je důležité pro NK buněčnou funkci při udržování homeostázy a imunitního dohledu. NK buňky cílí přímo na maligně transformované buňky, účastní se však také komplexní imunitní odpovědi, a to produkcí cytokinů nebo komunikací s ostatními imunitními buňkami. Na rakovinu můžeme nahlížet jako na prolomení imunitních bariér, kdy maligní buňky uniknou imunitě a zaplaví okolní tkáň, přičemž si kolem sebe vytváří mikroprostředí podporující růst nádoru. Tento proces může být zvrácen imunoterapií, tedy zásahem do formování imunitní odpovědi, což může vest k obnovení imunitního rozpoznávání. NK buňky jsou v imunoterapii důležitými efektorovými buňkami, mohou být použity pro adoptivní transfer, geneticky modifikovány pomocí chimerních antigenních receptorů nebo aktivovány příslušnými protilátkami. NK buněčné receptory, zodpovědné za rozpoznání cílových buněk a aktivaci cytotoxických mechanismů, jsou také jedním z cílů...
|
|
|
Studium ligandů fosfatas z rodiny haloacidních dehalogenas
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Fosfatasy z rodiny haloacidních dehalogenas jsou jedním z nástrojů, prostřednictvím nichž buňky provádí defosforylaci velmi rozmanitého množství endogenních i exogenních sloučenin. Kromě mnoha jiných se mezi fosfatasy této rodiny řadí enzymy Tt82 a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa II (cN-II), jimiž se tato diplomová práce zabývá. Enzym Tt82 pochází z termofilní archebakterie Thermococcus thioreducens a o jeho vlastnostech a biologické funkci je v současnosti známo jen málo. Na základě jeho strukturních a sekvenčních vlastností byla predikována fosfatasová katalytická aktivita a pomocí metody molekulového dokování navrženy potenciální substráty. Fosfatasová aktivita Tt82 byla v této diplomové práci potvrzena a spolu s tím nalezeno několik substrátů: AMP, D-glukosa-1-fosfát, D-glukosa-6-fosfát a p-nitrofenylfosfát (pNPP). Pro AMP a pNPP byla aktivita Tt82 detailně charakterizována při teplotách 37řC a 60řC a získány příslušné kinetické parametry. Aktivita enzymu byla pro oba substráty podstatně vyšší při teplotě 60 řC, což je v souladu s jeho původem z termofilního organismu. Efektivita katalytické aktivity Tt82 vůči identifikovaným substrátům je přesto poměrně nízká a patrně se tedy nejedná o biologicky relevantní substráty tohoto enzymu. Je však pravděpodobné, že Tt82 má mnohem širší substrátovou...
|
|
|
Studium struktury transkripčních faktorů regulujících metabolismus pankreatických beta buněk
Duchoslav, Vojtěch ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Nkx6.1 je homeodoménový protein o velikosti 37,8 kDa a důležitý transkripční faktor regulující transkripci významných genů beta pankreatických buněk. Nedostatečná exprese tohoto proteinu vede k porušené transkripci glukozového přenašeče Glut2, jejímž důsledkem je snížené vychytávání glukózy z krve a narušení celého metabolismu glukózy. Dále je potlačena proliferace beta pankreatických buněk kvůli nízké transkripci mitogenu cyclin D2 spouštějícího mitotické dělení buněk. V neposlední řadě se vážně naruší biosyntéza inzulinu špatnou transkripcí genů pro proteiny Ero1lb a Slc30a8, což vede k poklesu jeho produkce. Nkx6.1 hraje roli v patogenezi cukrovky druhého typu. Při tomto onemocnění vykazují beta buňky zmenšenou schopnost kompenzovat zvýšený požadavek na produkci inzulinu. Důvodem je nízká sekrece inzulinu a smrt beta pankreatických buněk. Jedna z možných příčin muže být špatná regulace transkripce genů, účastnících se zmíněných procesů. Nkx6.1 rozeznává vysoce konzervovanou oligonukleotidovou sekvenci DNA (TTAATTAC). Vazba k DNA je navíc regulována doménou se zvýšeným výskytem kyselých aminokyselinových zbytků na karboxylovém konci molekuly. V rámci bakalářské práce byly přiřazeny rezonance atomů hlavního řetězce proteinu Nkx6.1 pomocí metody nukleární magnetické rezonance (NMR). K tomuto účelu...
|
|
|
Structural studies of selected signaling protein complexes.
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Schopnost proteinů vázat jiné molekuly v reakci na různé podněty ve svém mikrookolí je základem rozsáhlých regulačních sítí, které koordinují následnou činnost buněk. Správná funkce těchto signálních drah závisí převážně na nekovalentních interakcích, které často ovlivňují strukturu proteinů a proteinových komplexů. Pochopení molekulárního mechanismu funkce proteinu v buněčné signalizaci je proto často závislé na znalosti jeho trojdimenzionální struktury. V této disertační práci představuji studie, které vedly na molekulární úrovni k pochopení několika protein-proteinových a ligand-proteinových interakcí podílejících se na buněčné signalizaci. Použila jsem nukleární magnetickou rezonanci (NMR), malo- úhlový rozptyl rentgenového záření (SAXS) a další biofyzikální metody pro určení molekulární podstaty inhibice čtyř signálních proteinů: vápník/kalmodulin (Ca2+ /CaM)- dependentní proteinkinasy kinasy 2 (CaMKK2); proteasy kaspasa-2; forkhead transkripčního faktoru FOXO3 a proteinkinasy ASK1. Konkrétněji byla zkoumána role proteinu 14-3-3 a CaM v regulaci CaMKK2 aktivity. Dále byl detailně studován mechanizmus, jakým protein 14-3-3 ovlivňuje schopnost oligomerizace a jaderné lokalizace kaspasy-2 a také byla objasněna podstata modulace transkripční aktivity FOXO transkripčních faktorů díky zkoumání...
|
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
|
|
Využití specifických inhibitorů karbonické anhydrázy IX pro fluorescenční značení rakovinných buněk
Pospíšilová, Klára ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Lidské karbonátlyázy jsou metaloenzymy, které se účastní mnoha fyziologických pochodů v organismu, ale hrají také roli v patogenezi řady chorob. Karbonátlyáza IX (CAIX) se, na rozdíl od ostatních 15 izoenzymů lidských karbonátlyáz, za normálních podmínek vyskytuje v organismu jen v omezené míře, avšak v hypoxických nádorech je vysoce exprimovaným znakem na povrchu buněk. Z tohoto důvodu je tento enzym dobrým cílem pro terapii a diagnostiku nádorů, a proto jsou proti CAIX vyvíjeny různé monoklonální protilátky i specifické inhibitory. V této práci byla ověřována možnost využít polymerní konjugát nesoucí specifický inhibitoru CAIX ke fluorescenčnímu značení rakovinných buněk. Prostřednictvím průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie byla testována specifická vazba polymerního konjugátu na různých buněčných liniích a schopnost vazby tohoto polymerního konjugátu byla srovnávána s CAIX specifickou monoklonální protilátkou M75 a jejím jednořetězcovým fragmentem scFv M75. Dále byly zjišťovány schopnosti testovaného konjugátu inhibovat enzymovou aktivitu CAIX. Pro tyto experimenty byl připraven a purifikován rekombinantní protein CAII, který byl dále též využit pro účely proteinové krystalizace. Testy inhibičních aktivit rovněž umožnily vytipovat nové inhibitory CAIX, které by mohly být díky lepším...
|
|
|
Structural studies of LEDGF/p75 interactions
Těšina, Petr ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Spiwok, Vojtěch (oponent)
4 ABSTRAKT Protein LEDGF/p75 je lidský transkripční koaktivátor, který je asociován s epigenetickými modifikacemi transkripčně aktivního chromatinu. Je také nezbytný v procesu integrace HIV do genomu hostitelské buňky a v leukemogenezi způsobené fúzními produkty genu kódujícího protein MLL1. Interakce proteinu LEDGF/p75 s HIV integrázou a komplexem MLL1-menin jsou považovány za potenciální cíl terapeutického zásahu. Interakce proteinu LEDGF/p75 s HIV integrázou i MLL1 jsou zprostředkovány tzv. integrázu vážící doménou (IBD - integrase binding domain). Zatímco patofyziologické interakce IBD LEDGF/p75 byly intenzivně studovány, těm fyziologickým byla věnována malá pozornost. Mimo HIV integrázy a MLL1 interaguje LEDGF/p75 skrze IBD také s proteiny JPO2, PogZ, ASK a MLL2. Jelikož se interakce IBD s HIV integrázou stala cílem pro vývoj inhibitorů, bylo nutné získat informace o ostatních interakcích této domény. Jen díky detailní charakterizaci všech interakcí IBD je možné zajistit specifické cílení vyvíjených inhibitorů. Proteinový komplex IBD-MLL1-menin byl již dříve strukturně charakterizován, ale pouze částečně. Pomocí NMR spektroskopie se nám podařilo zmapovat novou interakční oblast komplexu IBD-MLL1. Toto navazující interakční rozhraní je schopné zajistit interakci IBD s MLL1 i bez přítomnosti meninu,...
|
|
|
Strukturní biologie enzymů metabolizujících merkaptopurin
Soldánová, Anna ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Merkaptopurin (6-merkaptopurin) patří společně s příbuznými látkami azathioprinem a 6-thioguaninem mezi široce používaná chemoterapeutika a imunosupresiva. Během terapie thiopurinovými léčivy se mohou u pacientů objevit závažné nežádoucí účinky, jako například myelosuprese, nebo snížená terapeutická účinnost podávaného léčiva. Rozvoj metod sekvenace DNA a RNA umožnuje rozpoznat některé z příčin zmíněných problémů - různé genetické varianty enzymů účastnících se metabolismu fyziologických purinů a thiopurinových léčiv. Některé známé varianty těchto enzymů zásadním způsobem ovlivňují koncentraci cytotoxických forem thiopurinů, které mají dopad na úspěšnost a snášenlivost terapie. V současnosti je popsáno několik mutantních variant genů enzymů metabolizujících thiopurinové deriváty, ale molekulární mechanismy vlivu těchto mutací nejsou dosud dostatečně prostudovány. Znalost trojrozměrné struktury těchto enzymů může objasnit projevy dané genetické varianty na úrovni proteinu a její efekt na biologickou aktivitu thiopurinů. Tato práce se zaměřuje zejména na biochemicko-strukturní popis thiopurin-S-methyltransferasy, fosfatasy NUDT15 a cytosolické 5′-nukleotidasy II. Shrnuje problematiku s důrazem na význam strukturní biologie v interpretaci úlohy mutantních variant těchto enzymů v metabolismu thiopurinových léčiv.
|
|
|
Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology
Škerlová, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
K pochopení funkce proteinu významně přispívá znalost jeho trojrozměrné struktury, obzvláště v případě komplexů s ligandy. Metody strukturní biologie, jako je rentgenová krystalografie, SAXS nebo NMR, jsou proto ve strukturní analyse interakcí proteinů s ligandy široce využívány. V této práci byly tyto metody využity k objasnění molekulární podstaty dvou biologických dějů využívajících proteinové interakce: rentgenostrukturní analysa byla použita ke studiu vazby efektorové molekuly k prokaryotnímu transkripčnímu faktoru, metody NMR a SAXS byly využity ke studiu interakce monoklonální protilátky s proteinovým antigenem. Transkripční regulátor DeoR negativně reguluje expresi katabolických genů pro utilizaci deoxyribonukleosidů a deoxyribosy v bakterii Bacillus subtilis. DeoR se skládá z N-koncové DNA-vazebné domény a z C-koncové efektor-vazebné domény (C-DeoR). Jeho funkce je regulována vazbou nízkomolekulárního efektoru deoxyribosa-5-fosfátu. Vyřešili jsme krystalové struktury C-DeoR ve volné formě a v komplexu s deoxyribosa-5-fosfátem. Strukturní analysa odhalila unikátní vazbu mezi molekulou efektoru a lysylovým zbytkem efektor-vazebného místa prostřednictvím reversibilní dvojné vazby typu Schiffovy base. Fysiologická relevance této vazby byla potvrzena mutačními experimenty a také analysou tvorby...
|
|
|
Expression and characterization of recombinant capsid protein from HIV and its mutants: towards inhibition of virus assembly
Sivá, Monika ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Virus HIV je pro svět hrozbou již třicet let. Způsobuje syndrom získaného selhání imunity (AIDS), při kterém je infikovaný jedinec náchylný k nádorovým onemocněním a život ohrožujícím infekcím. Součástí kombinované antiretrovirové terapie je mnoho léčiv potlačujících množení viru HIV. Ta však pouze zpomalují průběh onemocnění. Protože zatím nebyla objevena žádná dostatečně efektivní léčba, odborníci neustále hledají nové cíle terapeutického zásahu včetně možnosti virus z těla zcela vymýtit. Díky svým multimerizačním vlastnostem je kapsidový protein HIV potenciálním cílem pro inhibici skládání infekční virové částice. N-terminální doména šesti kapsidových proteinů vytváří hexamery a pentametry. Díky proteinové krystalografii a na základě NMR měření víme, že jsou k sobě vázané dimery C-terminální domény. Existují inhibitory, které se vážou na C-terminální doménu, pozměňují její konformaci a mohou tak ovlivnit protein-proteinové interakce dimeru. Tento efekt lze popsat několika metodami, například proteinovou mikrokalorimetrií. Rekombinantní kapsidový protein tzv. divokého typu a jeho C-terminální doména, jež oba dimerují v roztocích i krystalech, byly připravené v bakteriích a dále vyčištěny. Jejich dimerizační konstanta byla změřená izotermální titrační kalorimetrií. Rekombinantní kapsidový protein a jeho...
|
host ::
RSS.