|
|
Využití magnetických částic pro izolaci DNA z vybraných druhů koření
Gaňová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolácia DNA z rastlinného pletiva v požadovanej kvalite je veľmi komplikovaná, hlavne z dôvodu prítomnosti látok, ktoré môžu interferovať pri amplifikácii DNA. Týmito látkami sú hlavne polyfenoly, polysacharidy, proteíny a rôzne farbivá. Chemická rôznorodosť takýchto látok môže mať významný vplyv na výťažok a kvalitu DNA pri použití jedného izolačného postupu. Hlavným cieľom práce bolo vyhodnotiť použitie mikroizolačného protokolu u príbuzných matríc na kvalitu izolovanej DNA ako aj zhodnotenie vplyvu inhibítorov izolovaných spolu s nukleovou kyselinou na jej amplifikáciu v PCR. DNA bola izolovaná zo sušenej mletej papriky (Capsicum annuum). V prvej fáze boli vzorky homogenizované s použitím lyzačného roztoku s cetyl trimetyl amónium bromidom. Následne bola DNA purifikovaná pomocou reverzibilnej adsorbcie na magnetické nosiče. Celkom bolo testovaných šesť rôzne modifikovaných nosičov. Koncentrácia a čistota získanej DNA bola stanovená spektrofotometricky meraním absorbancie roztoku DNA v TE pufre. Kvalita DNA bola overená amplifikáciou v PCR. Boli použité priméry špecifické pre rastlinnú ribozomálnu DNA (rDNA). Prítomnosť produktov PCR bola dokázaná agarózovou gélovou elektroforézou. Bolo zistené, že použitou mikrometódou je možné izolovať DNA odpovedajúcej čistoty, ktorá je vhodná pre genetickú analýzu pomocou PCR. Boli zistené rozdiely medzi magnetickými nosičmi, ktoré boli testované pre izoláciu DNA.
|
|
|
Dynamika a mechanismus umlčování reportérového genu pro GFP v závislosti na aktivitě RDR6 a způsobu indukce RNA interference v buněčné linii tabáku BY-2
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent)
RNA interference (RNAi) je proces, který se u rostlin prostřednictvím malých RNA (sRNA = small RNA) významně podílí na regulaci genové exprese. Rozmanité dráhy RNAi lze rozdělit na dva základní mechanismy, a to posttranskripční a transkripční umlčování (PTGS a TGS). Vznik sRNA je vždy závislý na přítomnosti dvouvláknové molekuly RNA (dsRNA), která je štěpena některým z DCL proteinů za vzniku sRNA obvykle o délce 21 - 24 nt a jedno z vláken sRNA je následně rozpoznáno proteinem AGO. V případě PTGS interaguje komplex AGO- sRNA na základě komplementarity sekvence sRNA s cílovou RNA, kterou rozštěpí nebo zablokuje její translaci. U TGS reaguje AGO s rostlinně specifickou RNA Pol V a jejími transkripty, se kterými opět páruje vlákno sRNA nesené proteinem AGO. Tato interakce umožní sestavení komplexu proteinů, které indukují metylaci DNA a posléze i histonů, jež působí inhibičně na transkripci RNA Pol II. Způsobů, jakými může dsRNA vznikat, je celá řada. Velká část v buňce tvořených dsRNA je závislá na syntéze komplementárního vlákna do podoby dsRNA prostřednictvím RDR6 (RNA dependentní RNA polymeráza 6), která je zapojena i do procesu vzniku sekundárních sRNA. Význam RDR6 při PTGS byl zkoumán pomocí reportérového genu pro GFP, a to při samovolném umlčování a při umlčování vyvolaném třemi odlišnými...
|
|
|
Study of RNAi mechanisms in tobacco BY-2 cell line and potato plants
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Znalosti o procesech RNA interference, tedy regulace genové exprese prostřednictvím malých RNA (sRNA), se za posledních 30 let nebývale rozrostly. Některá zjištění byla doslova revoluční, neboť odhalila děje, které převrátily mnohé dosud zažité představy. Řada jevů se ukázala být značně konzervovaná a společná různým druhům organismů, jiné jsou však specifické pro určité vývojové větve či dosud ne zcela prozkoumané. Chybí také znalost o propojení četných drah - kupříkladu mezi umlčováním na transkripční (TGS, vedoucí k metylaci promotoru) a posttranskripční úrovni (PTGS, ovlivňující stabilitu mRNA či translaci). Předkládaná práce shrnuje poznatky dvou publikovaných a dvou dosud nepublikovaných prací a pokouší se prostřednictvím různých rostlinných modelových organismů popsat některá z méně známých míst RNA interference. Výzkum na transgenních liniích Solanum tuberosum odhalil možnost obnovit pomocí 5- azacytidinu expresi transkripčně umlčených transgenů na úrovni celých rostlin. Regenerace de novo z listů takovýchto rostlin může vést k opětovnému umlčení reaktivovaných transgenů a sloužit tak jako selekční metoda pro vyřazení linií náchylných k samovolnému umlčení. Charakter změn v expresi dvou sledovaných reportérových genů naznačoval spřažení PTGS a TGS, ale také, možnost postupného šíření...
|
|
|
Isolation and detection of DNA from plant species important for food prodution
Orel, Matúš ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
In the food industry, it is very important to take care of the quality, safety and organoleptic properties of the products supplied. For this reason, food must be checked. However, not all information can be found using conventional techniques such as immunoassays, chromatographic techniques, etc. DNA-based techniques can be used for these cases where traditional procedures are insufficient. Among them, the best known technique is PCR. The aim of the thesis was to isolate DNA from vegetable samples (broccoli, beetroot, carrot and pepper). DNA was isolated using the magnetic particle method and the traditional CTAB method. Both methods were able to isolate the DNA from the vegetable samples in quality and at a concentration suitable for PCR, where the 35S rDNA gene region was amplified (more precisely about 700 bp of the 18S-ITS1-5,8S region). After amplification, the PCR products were subjected to restriction reactions and the results compared to bioinformatic analysis. These steps have succeeded in finding suitable enzymes for diferentiation of PCR products from the tested vegetable species.
|
|
|
Evaluation of a micromethod for isolation of DNA from plant leaf, fruit and fruit products
Balažovičová, Nikola ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
The thesis has been focused on testing of micromethod of DNA isolation from leaves, fruits and fruit products. Jams were selected for the analysis of plant DNA in technologically processed foods. Plant leaves, fruits, and jams were homogenized using plastic copist in a lysis buffer containing 2% cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) with 2.5M sodium chloride (NaCl). Microisolation of plant DNA was performed using poly(hydroxyethylmethacrylate-co-glycidylmethacrylate) – P(HEMA-co-GMA)microparticles. Isolated the DNA concentration and purity were assessed by UV light aborbance using a spectrophotometer. After that, amplification of the DNA was tested in PCR. Primers specific for plant ribosomal DNA: 18S_for a 5,8S_rev (PCR product - 700bp), 26S_for a 26S_rev (PCR product - 220 bp), 18S_for a 18¬S_rev (PCR product - 263 bp) were used. The PCR conditions were optimized and the effect of the amplicon length on its detection was followed. PCR products were detected by agarose gel electrophoresis. It was shown that DNA isolated from almost all of leaves using magnetic particles was in PCR-ready quality in contrary to the fruits. DNA amplified in PCR with primers giving short PCR products was isolated from almost all tested jams. The method must be optimalised, yet.
|
|
|
The role of hybridization in plant evolution - using different methods for detecting plants of hybrid origin in the Elytrigia repens - Elytrigia intermedia hybrid complex
Paštová, Ladislava ; Krahulec, František (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Blattner, Frank (oponent)
Hybridizace je důležitým fenoménem v evoluci rostlin - je jedním ze zdrojů nové genetické variability. Hybridizací dochází ke sloučení genomů doposud izolovaných evolučních linií. Určování rostlin hybridního původu je výzvou v mnoha taxonomických skupinách. Velké spektrum metod bylo využito k jejich detekci od počátku botanického výzkumu. Zavedení genomické in situ hybridizace mělo velký dopad na studium rostlin hybridního původu. Tato molekulárně cytogenetická metoda umožňuje zjistit genomový příspěvek jednotlivých rodičovských druhů. Hybridizace (spolu s polyploidizací) významně přispěla k dnešní diverzitě tribu Triticeae. Většina druhů jsou allopolyploidy, kteří jsou výsledkem časté mezidruhové a mezirodové hybridizace. Struktura příbuzenských vztahů mezi zástupci tribu je tak značně retikulátní. Tato práce je zaměřena na studium hybridního komplexu Elytrigia repens - E. ×mucronata - E. intermedia. (1) Zástupci studovaného hybridního komplexu jsou málo morfologicky diferencovaní - jen 2 morfologické znaky jsou používány k jejich odlišení. Byla studována variabilita anatomických znaků listové čepele. Byly nalezeny znaky vhodné pro rozlišení rodičovských druhů. Využití znaků je omezeno, protože někteří kříženci nesou jen varianty znaků jednoho z rodičovských druhů. (2) Původ allohexaploidního...
|
|
|
Srovnání různých typů magnetických nosičů při mikroizolaci DNA z potravin
Koplík, Jerguš ; Lunerová,, Jana (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Byl optimalizován postup mikroizolace DNA v kvalitě pro PCR z vybraných čerstvých a sušených semen luštěnin a potravinových výrobků obsahujících luštěniny (humus). Pro optimalizaci byly použity magnetické mikročástice PGMAox a optimální navážka rostlinných a potravinových materiálů byla zvolena 200 mg. Pro čerstvé rostlinné materiály byl zvolen izolační postup zahrnující použití lyzačního roztoku s CTAB o objemu 500 L, 1 L -merkaptoethanolu a 500 L směsi chloroform-oktanol. Pro izolaci DNA ze sušených semen luštěnin a potravinových výrobků byl navýšen objem lyzačního roztoku s CTAB na 1 000 L. Pro dosažení vyšší čistoty DNA byly některé připravené homogenáty přesráženy isopropylalkoholem. Optimalizovaný proces izolace DNA byl použit při přípravě homogenátu z potravinových výrobků, ze kterých byla izolována DNA různými magnetickými nosiči. Pro srovnání magnetických nosičů byly použity neporézní nosiče poly(glycidylmethakrylát) PGMAox, poly(2-hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) P(HEMA-co-GMA)ox, pokryté karboxylovými skupinami a porézní hypersíťované mikročástice poly(styren-co-divinylbenzen) HPS-B-M-22-NH2, magnetické porézní sklo MPG a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) PLL. V průměru nejvyšší koncentrace a nejlepší čistota DNA byla izolována použitím magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA)ox a PGMAox.
|
|
|
Příprava vzorků pro analýzu DNA v potravinách rostlinného původu
Silná, Renata ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace vysoce kvalitní rostlinné DNA je nezbytná pro mnoho aplikací molekulární biologie. Nicméně, rostlinná DNA a potraviny rostlinného původu obsahují velké množství polysacharidů, polyfenolů a jiných sekundárních metabolitů, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA. Cílem této diplomové práce byla příprava vzorků a různých potravinových matric pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Jednalo se o 5 druhů zeleniny a 10 druhů různě zpracovaných zeleninových potravinových výrobků. Homogenizace matric byla provedena v CTAB pufru. Izolace rostlinné DNA byla provedena magnetickými částicemi s navázanými karboxylovými skupinami. Veškerá DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, testována dvěma sadami primerů umožňujících amplifikaci 700 bp amplikonů, u tepelně zpracovaných výrobků na 220 bp a pro PCR v reálném čase. Byla srovnána účinnost separace magnetických částic s navázanou DNA pomocí magnetického separátoru a magnetické jehly. DNA vyšší čistoty byla izolována magnetickou jehlou. Mikrometoda izolace rostlinné DNA z homogenátů s CTAB pomocí magnetických částic je vhodná pro různě zpracované potraviny.
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA z výrobků pro dětskou výživu
Pešková, Aneta ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace rostlinné DNA je komplikovaná z důvodu přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a dalších metabolitů, které bývají izolovány současně s DNA. Tyto látky mohou mít vliv na výtěžek a kvalitu izolované DNA, a také mohou působit jako inhibitory PCR. Mezi moderní, jednoduché a rychlé metody izolace DNA v molekulárně biologických laboratořích patří magnetická separace, která využívá reverzní imobilizaci DNA na magnetické nosiče a umožňuje získání DNA ve vysoké kvalitě a čistotě. V experimentální části byla provedena mikroizolace rostlinné DNA ze zeleniny (mrkev), ovoce (hruška, jablko, citron, mango) a z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti (Hami první mrkvička, Nestlé ovocná kapsička, dmBIO hruška mrkev jablko, Hello ovocná přesnídávka s jablky a Hello ovocná přesnídávka s mangem). K izolaci DNA byly využity magnetické mikročástice PGMA 2 mg/ml a magnetické nanočástice funkcionalizované poly-L-lysinem (PLL) 0,2 mg/ml. Byla porovnána metoda izolace magnetických částic s navázanou DNA magnetickým separátorem a magnetickou jehlou. Kvalita a množství izolované DNA byly zjištěny spektrofotometrickou analýzou a amplifikovatelnost izolované DNA byla ověřena konvenční polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s primery specifickými pro rostlinnou ribosomální DNA (rDNA). Produkty PCR o velikosti 700, 350 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti byla pomocí magnetických nosičů izolována DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Detegovány byly však pouze kratší PCR produkty o velikosti 220 bp, což svědčí o degradaci DNA. Specifita PCR produktů byla stanovení analýzou délky restrikčního fragmentu (RFLP). Experimentální výsledky odpovídaly teoretickým výsledkům restrikční analýzy.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
host ::
RSS.