|
|
Zapojení proteinu vinkulinu do savčí gametogeneze
Darášová, Alžběta ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Kaňka, Jiří (oponent)
Jednou ze základních vlastností živých soustav je pohlavní rozmnožování, při kterém dochází ke splynutí pohlavních buněk, spermie a vajíčka. Klíčovým procesem, při tvorbě pohlavních buněk, je meióza. Při meiotickém dělení dochází k dramatickým změnám v jádře, při kterých se mohou vyskytnout chyby, které mohou zapříčinit různé chromozomové aberace a nondisjunkce vedoucí ke genetickým onemocněním a v neposlední řadě k neplodnosti. Příčiny neplodnosti jsou velmi různorodé, avšak velká část pochází právě z chyb při meióze. Pro správné fungování tohoto procesu je velmi důležitá první fáze meiózy I, profáze I, kde dochází k párování homologních chromozomů za pomoci bílkovinné struktury synaptonemálního komplexu (SC) a následně dochází ke genetické rekombinaci, tzv. crossing-overu. Vinkulin (VCL) je cytoplazmatický protein vázající aktin ve fokálních adhezích a adherentních spojích a je jejich esenciálním regulátorem. Tento protein byl však objeven i v jádře pohlavních buněk u některých organizmů. Jaderné funkce vinkulinu však dosud nebyly popsány. Tato diplomová práce se zaměřuje na studium dynamiky chromozomů v gametogenezi na myším modelu s důrazem na zapojení jaderného vinkulinu (VCL) do těchto procesů. Naším cílem bylo lokalizovat VCL v jádře embryonálních profázních oocytů pomocí fluorescenční...
|
|
|
Faktory ovlivňující vývoj parthenogenetických embryí myši
Jettmarová, Dominika ; Fulka, Josef (vedoucí práce) ; Kaňka, Jiří (oponent)
Vývoj haploidních parthenogenetických embryí myši (Mus musculus) nedosahuje stejné úrovně jako je tomu u normálních embryí. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda se haploidní parthenogenetická embrya myši odlišují nukleocytoplasmatickým poměrem. Objem jádra parthenogenetických embryí roste s ploiditou. Nukleocytoplasmatický poměr haploidních embryí se mezi dvoubuněčným a čtyřbuněčným stádiem statisticky neliší (p = 0.052), u diploidních a tetraploidních embryí byl naopak statisticky významný rozdíl (p < 0.001). Nestandardní nukleocytoplasmatický poměr by mohl souviset s problematickým vývojem. Pochopení faktorů ovlivňujících preimplantační vývoj parthenogenetických embryí zvýší efektivitu derivace haploidních embryonálních kmenových buněk.
|
|
|
Effect of selected endocrine disruptors on the male mouse reproductive system in vivo
Žatecká, Eva ; Pěknicová, Jana (vedoucí práce) ; Kubelka, Michal (oponent) ; Kaňka, Jiří (oponent)
Souhrn Každý den je do našeho prostředí uvolňováno ohromné množství tzv. polutantů životního prostředí, které mohou negativně ovlivnit naše zdraví. Některé z těchto sloučenin jsou hormonálně aktivní látky (tzv. endokrinní disruptory), které mohou interferovat s naším hormonálním systémem. Hormonální systém ovlivňuje správnou funkci mnoha fyziologických procesů a je jeden z nejdůležitějších regulačních systémů v organismu. I reprodukční systém je do značné míry regulován různými hormony a jejich správná funkce je zásadní pro tvorbu gamet, oplodnění a vývoj embrya. Proto znečištění životního prostředí je považováno za jednu z možných příčin zvýšené neplodnosti v lidské populaci. V našich studiích jsme se proto rozhodli studovat vliv dvou endokrinních disruptorů (tetrabrombisfenol A - TBBPA a zearalenon - ZEA) na samčí reprodukční systém myší in vivo. Podle našich výsledků je TBBPA schopen indukovat apoptózu testikulárních buněk, stejně jako změny v expresi vybraných testikulárních genů a protaminaci spermií. Dále naše výsledky naznačují, že při kontinuální expozici TBBPA dochází k akumulaci jeho negativního vlivu v další generaci v závislosti na tom, zda rodiče byli nebo nebyli ovlivněni. Jedním z možných mechanismů trans-generačního přenosu by mohly být pozorované změny v protaminaci spermií. Výsledky z naší...
|
|
|
Vliv diabetes mellitus na reprodukční parametry a expresi vybraných testikulárních genů na myším modelu
Valášková, Eliška ; Pěknicová, Jana (vedoucí práce) ; Kaňka, Jiří (oponent)
Podle Světové zdravotnické organizace (WHO, 2014), 15% párů v reprodukčním věku trpí neplodností, z toho více než 60% případů je způsobeno mužskou neplodností. Tento stav může být zapříčiněn genetickým pozadím jedince, podmínkami životního prostředí nebo například různými chorobami, zahrnující i diabetes mellitus (DM). Cílem této studie bylo proto určit vliv DM na reprodukční parametry a expresi vybraných testikulárních genů na myším modelu (FVB myší kmen). Ke studiu byl vybrán FVB inbrední myší kmen, u kterého byl DM (typ 1) uměle navozen látkou streptozotocin, která způsobuje destrukci buněk β slinivky břišní. Po 6 týdnech v diabetické prostředí byli dospělí samci usmrceni a podrobeni analýze. Naše výsledky ukázaly, že diabetické prostředí mělo vliv na váhu těla a reprodukčních orgánů stejně tak jako na ledviny a játra. Dále byla pozorována snížená koncentrace a viabilita u diabetických spermií porovnávaných s kontrolními. Stejně tak zvýšené značení apototického markeru annexinu V bylo zaznamenáno u ovlivněné skupiny. Dále byly porovnávány změny u jaderných proteinů spermií - protaminů. U diabetických zvířat byl sledován vyšší počet spermií s nedostatečnou protaminací. Nicméně, poměr mezi protaminem 1 a protaminem 2 (P1/P2) nebyl pozměněn u diabetických samců porovnávaných s kontrolními. V...
|
|
|
Nuclear dynamics and interactions of myosin 1c
Dzijak, Rastislav ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Kaňka, Jiří (oponent)
1. ABSTRAKT Myosiny jsou proteiny, které přeměňují chemickou energii uloženou v ATP na mechanickou sílu, která se aplikuje na vlákna aktinu. Jaderný myosin 1 (NM1) byl první myosin detekován v jádře buňky. Spolu s jaderným aktinem hraje důležitou roli při transkripci DNA a remodelaci chromatinu. Nicméně, molekulární mechanismy funkce NM1 jsou zatím neznámé. K získání dalších poznatků o tomto molekulárním motoru jsme studovali expresi a distribuci NM1 v tkáních, mechanismus jeho jaderné lokalizace a také jeho další molekulární interakce. V první části byla studována exprese NM1 v různých tkáních myší. Bylo prokázáno, že NM1 se vyskytuje v buněčných jádrech všech myších tkání, přičemž do studia nebyly zahrnuty buňky v terminálním stádiu spermatogeneze. Kvantitativní PCR a western blot prokázaly, že exprese NM1 je různá v jednotlivých myších tkáních a nejvyšší je v plicích. NM1 je izoforma dříve objeveného myosinu 1c (Myo1c), který byl popsán nejprve jako protein cytosolový. Jediný známý rozdíl mezi těmito dvěma proteiny je přítomnost 16 aminokyselin na N-konci NM1. V další části byl proto studován vliv NM1 domén, včetně N-koncového peptidu, na subcelulární lokalizaci tohoto proteinu. Zjistili jsme, že N-koncový peptid NM1 není nezbytný pro jeho vstup do jádra. Jaderný lokalizační signál jsme objevili v...
|
|
|
Identifikace genů nezbytně nutných pro normální průběh oplození a preimplantačního vývoje skotu v podmínkách in vitro
Toralová, Tereza ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Ješeta, Michal (oponent)
Cílem této práce bylo nalézt a charakterizovat geny, které jsou potenciálně nezbytné pro normální preimplantační vývoj. Podrobněji jsme charakterizovali tři geny - CENPF (centromeric protein F; mitosin), UCHL1 (ubiquitin C-terminal hydrolase-L1) a nukleofosmin (NPM1, B23, numatrin; NO38). Embryonální transkripce CENPF a nukleofosminu je aktivována v pozdním 8-buněčném stádiu (tj. v době embryonální genomové aktivace - EGA), a proto lze předpokládat, že jsou pro normální preimplantační vývoj nezbytné. CENPF je důležitý pro buněčné dělení, především zprostředkuje interakci mezi kinetochorem a mikrotubuly. Nukleofosmin je multifunkční jadérkový fosfoprotein, který se podílí zejména zpracováni rRNA, biogenezi ribozómů, duplikaci centriol a uplatňuje se také jako chaperon. Dále jsme na základě předpokládané úlohy během fertilizace vybrali gen UCHL1 a popsali jeho úlohu během oplození bovinních oocytů. UCHL1 je deubikvitinylační enzym, který koordinuje degradaci cytoplazmatických proteinů, recyklaci volného ubikvitinu z proteazomu a podílí se na regulaci fyziologické apoptózy. Úlohu CENPF a nukleofosminu jsme sledovali pomocí RNA interference (RNAi). Protein UCHL1 je velmi stabilní, a proto není pro jeho studium RNAi vhodná. Místo toho jsme využili dvou UCHL1 specifických inhibitorů, které inhibují jeho...
|
|
|
Transkriptomika embryonální genomové aktivace preimplantačního vývoje skotu v podmínkách in vivo a in vitro kultivace
Vodičková Kepková, Kateřina ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat transkripční profil in vivo a in vitro získaných embryí během bovinní minoritní a majoritní genomové aktivace a dále identifikovat mRNA transkripty, které jsou nově syntetizované během těchto stádií. V naší první studii jsme se zaměřili na studium minoritní aktivace genů ve 4-buněčném stádiu embrya. Pomocí metody supresivní subtraktivní hybridizace (SSH) jsme nalezli 31 amplikonů homologních s již známými geny. Pro podrobnější studium exprese během celého období preimplantačního vývoje jsme vybrali 5 genů: centromere protein, 350/400 kDa (CENPF, mitosin), splicing factor arginine/serine-rich 3 (SRFS3), high mobility group nucleosomal binding domain 2 (HMGN2) protein a eukaryotické translační iniciační faktory EIF4A2 a EIF4E. Všechny tyto geny hrají důležitou roli v raném vývoji embrya. Gen SRFS3 je prvním genem s významnou funkcí, jehož exprese byla nalezena již v průběhu minoritní genomové aktivace, což potvrdila citlivost jeho transkripce k α-amanitinu v tomto stádiu. Pro další studium jsme si vybrali gen CENPF (centromeric protein F, mitosin), jehož funkci během preimplantačního vývoje bovinního embrya jsme podrobně studovali pomocí specifického umlčení injikací double- stranded (dsRNA) do embrya ve stádiu zygoty. Zjistili jsme, že mikroinjekce CENPF dsRNA...
|
|
|
Exprese a funkce nukleofosminu (B23) během preimplantačního vývoje skotu
Benešová, Veronika ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Abychom mohli porozumět časné embryogenesi savců je potřeba identifikovat geny, které zahajují svou expresi v různou dobu embryonálního vývoje. Právě tyto geny hrají důležitou roli v normálním preimplantačním vývoji. Jedním z těchto genů je i nukleofosmin, gen pro multifunkční protein, který zastává mimo jiné úlohu transportního proteinu mezi cytoplasmou a jadérkem. Podílí se na duplikaci centrosomů, vytváření ribosomů a také zastává funkci chaperonového proteinu. Jeho lokalizace závisí na fázi buněčného cyklu a vlastně odpovídá průběhu tvorby jadérka. Ke studování vlivu nukleofosminu na preimplantační vývoj skotu byla použita metoda RNA interference, kdy po injikaci dlouhé dvouřetězcové RNA (dsRNA) dojde k degradaci cílové mRNA. Průměrný pokles množství mRNA u embryí injikovaných nukleofosminovou dsRNA je 86,3 % v porovnání s kontrolními neinjikovanými embryi. Pomocí imunofluorescence však nebyl zjištěn žádný rozdíl v expresi ani lokalizaci nukleofosminu mezi jednotlivými skupinami. Embrya ze všech skupin byla schopna se vyvíjet až do stádia blastocysty, i když v tomto stádiu byl signifikantní rozdíl ve vývoji do blastocysty mezi neinjikovanou kontrolní skupinou a embryi s umlčenou mRNA pro nukleofosmin. Nenalezli jsme ani defekty polymerace tubulinu, které byly pozorovány u somatických buněk.
|
|
|
Measurement of amplitude and phase of ultrashort optical pulses by using nonlinear processes in optical fibres
Vraný, Boleslav ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Karásek, Miroslav (oponent) ; Boháč, Leoš (oponent)
I confirm that I worked out this doctoral thesis independently and that I quoted all the literature used. Prohlašuji, že jsem tuto dizertační práci vypracoval samostatně a že jsem uvedl veš- kerou použitou literaturu. V Praze dne 21. 6. 2010 Abstract The thesis deals with the Frequency-Resolved Optical Gating (FROG) method of mea- suring ultrashort optical pulses. As a nonlinear process involved in the method we used cross-phase modulation in a microstructured optical fiber. The FROG device made of fi- ber pigtailed components fitted well the needs of our fiber optical laboratory. The output of the measurement differs significantly from FROG methods that use other nonlinear processes like second harmonic generation. For our FROG, the standard algorithms for reconstruction of the complex envelope from measured spectrogram failed. We therefore used a more robust genetic algorithm (GA) for the reconstruction. GA has several pa- rameters that affect its runs and we explored the influence of these parameters on the success of reconstruction of a number of test pulses and found the optimal set of these parameters. In this work, we present a general discussion of the FROG method and the standard reconstruction algorithms, the experimental setup we used, a discussion of the genetic algorithm, the technical details of our...
|
|
|
Genová exprese v průběhu expanze oocyt-kumulárních komplexů a časného embryonálního vývoje savců
Němcová, Lucie ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Lopatářová, Miloslava (oponent)
31 4 SHRNUTÍ Zavedla jsem real-time RT-PCT mezi základní metodiky, využívané v naší laboratoři. Během in vitro kultivace prasečích oocytů, kumulárních a granulózních buněk a in vivo expanze oocyt kumulárních komplexů byl stanoven expresní profil GDF9 mRNA, proteinu z rodiny TGFβ faktorů. Získaná parciální sekvence byla vložena do databáze EMBL/GenBank/DDBJ a gen byl lokalizován na prasečím chromozomu 2. Na rozdíl od myši byl transkript detekován poprvé též v granulózních i kumulárních buňkách rostoucích a preovulačních folikulů. Hladina GDF9 mRNA během in vitro kultivace i in vivo expanze klesala ve všech vzorcích. Popsali jsme signální dráhy, kterými insulínový růstový faktor I (IGFI) zvyšuje FSH-stimulovanou expanzi oocyt-kumulárních komplexů. Potvrdili jsme, že IGFI v kombinaci s FSH zvyšuje produkci hyaluronové kyseliny. Během kutivace kumulárních buněk s FSH došlo k postupnému snížení exprese Has2 mRNA. Avšak po 20 hodinách byla hladina stále detekovatelná v případě, kdy byl do média přidán i IGFI. Pomocí inhibitorů Akt a MAP kinázy jsme prokázali, že aktivita obou kináz je důležitá pro produkci i retenci HA. U bovinních blastocyst, připravených za rozdílných experimentálních podmínek (in vitro, in vivo v ovčím vejcovodu a v kombinaci obou způsobů) byla stanovena exprese genů pro Bax, L37 a S3a. V...
|
host ::
RSS.