|
| |
|
|
Structure and function of C-type lectin NK cell receptors studied by recombinant expression and protein crystallography
Vaněk, Ondřej ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze 2010 Struktura a funkce C-lektinových receptorů NK buněk studovaná pomocí rekombinantní exprese a proteinové krystalografie Abstrakt dizertační práce Ondřej Vaněk Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. NK buňky (přirození zabíječi) byly popsány pro jejich schopnost spontánně zabíjet určité allogenní nádorové linie, a to bez jakékoliv předchozí senzitizace. NK buňky jsou součástí neadaptivní imunitní odpovědi s velmi krátkou reakční dobou vůči patogenům, jakými jsou například viry, intracelulární bakterie a parazité. Jsou také zodpovědné za eliminaci některých rakovinných buněk a mohou tak bránit rozvoji nádorové transformace a bojovat proti rozšiřování metastáz. Aktivita NK buněk je regulována pomocí rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály zprostředkovanými povrchovými receptory NK buněk. Ze strukturního hlediska může být většina NK buněčných povrchových receptorů klasifikována jako C- lektinové nebo imunoglobulinové receptory. Jednou z mnoha podskupin C-lektinů jsou i lymfocytární receptory II. typu, které jsou exprimovány na NK buňkách. Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním bylo nalezení vhodných expresních a purifikačních systémů pro vybrané C-lektinové receptory NK buněk a druhým pak provést jejich biochemickou a...
|
|
|
Studium struktury a interakcí vybraných forkhead transkripčních faktorů
Kohoutová, Klára ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato magisterská práce vznikla jako součást projektu, jehož cílem je vývoj a studium nízkomolekulárních látek schopných inhibovat aktivitu transkripčního faktoru FOXO3. FOXO3 tvoří spolu s FOXO1, FOXO4 a FOXO6 FOXO podrodinu forkhead rodiny transkripčních faktorů. FOXO transkripční faktory jsou evolučně konzervované proteiny, které se účastní regulace celé řady buněčných dějů, mezi něž spadá regulace apoptózy, buněčného cyklu a metabolismu. Díky své proapototické funkci a schopnosti blokovat buněčný cyklus jsou FOXO proteiny považovány za tumorové supresory. Nicméně se ukazuje, že jejich zvýšená aktivita souvisí s mnoha typy rakovinného bujení. FOXO proteiny působí jako regulátory buněčné homeostáze, zvyšují odolnost nádorů vůči chemoterapii a podporují jejich růst. Cílem tohoto projektu je vyvinout specifické inhibitory schopné vázat se na DNA-vazebnou doménu, zkráceně DBD (z angl. DNA-binding domain, residua 156-269), FOXO3 a znemožnit tak její vazbu na DNA. Vývoj specifických inhibitorů FOXO3 vyžaduje znalost struktury DBD všech FOXO proteinů a detailní znalost jejich interakce s DNA. Doposud jsou známy struktury komplexů DNA s DBD FOXO1, FOXO3, FOXO4 a struktury volných DBD FOXO3 a FOXO4. V této práci byla vyřešena struktura volné DBD FOXO1. V předchozí práci byla studována sloučenina S9, která...
|
|
|
Podrobná charakterizace interakce mezi LEDGF/p75 a MeCP2
Naušová, Karolína ; Veverka, Václav (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent)
Epigenetika je vědní obor zabývající se studiem dědičných změn fenotypu, které nejsou způsobeny změnou v sekvenci DNA. Mezi hlavní epigenetické mechanismy spadá kovalentní modifikace DNA, zejména methylace, modifikace histonů a s tím spojená modifikace chromatinu, a RNA interference. Tyto mechanismy se mohou uplatnit během řady procesů, od transkripce až po translaci. LEDGF/p75, z angl. Lens epithelium-derived growth factor, je všudypřítomný protein lidského těla považovaný za transkripční koaktivátor upregulovaný za stresových podmínek. Skládá se z několika domén, z nichž na svém N-konci obsahuje PWWP doménu, která je schopna vázat di- a trimethylovaný lysin 36 na histonu 3 - tedy epigenetickou značku transkripčně aktivního chromatinu. Mezi jeho interakční partnery patří například HIV integráza, MLL1-MENIN komplex nebo protein MeCP2. Kratší izoformou tohoto proteinu je LEDGF/p52 sdílící s LEDGF/p75 jeho N-koncovou část důležitou pro interakci s DNA a chromatinem. MeCP2, z angl. Methyl-CpG-binding protein 2, je rovněž všudypřítomným proteinem lidského těla, ovšem s nejvyšší koncentrací v mozku. Jedná se o transkripční modulátor remodelující chromatin, jehož funkcí je proto aktivace nebo represe genu v závislosti na molekulárním a buněčném kontextu. Mimo jiné je zapojen v regulaci sestřihu RNA,...
|
|
|
Strukturní NMR studie proteinových komplexů
Hexnerová, Rozálie ; Veverka, Václav (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Protein-proteinové interakce se podílejí na celé řadě biologických procesů. Podrobná charakterizace jejich strukturní podstaty je důležitým nástrojem k pochopení s nimi spojených základních molekulárních mechanismů. Získané informace jsou důležité nejen pro biologii, ale také hrají důležitou roli při hledání míst vhodných pro terapeutickou intervenci. Ve strukturní biologii je nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (NMR) spolu s rentgenovou krystalografií a jednočásticovou kryo-elektronovou mikroskopií jednou z klíčových technik s vysokým rozlišením. Její použití fyzicky limitováno velikostí studovaných molekul, ale tuto nevýhodu vynahrazuje unikátní možností pracovat s dynamickými nebo heterogenními systémy. V této disertační práci byla pro detailní strukturní charakterizaci vybraných biologicky významných proteinů a jejich komplexů využitá právě NMR poskytující důležité informace o jejich biologických rolích. Ve třech různých projektech jsem studovala (i) vztah mezi strukturními účinky konkrétních modifikací inzulínového růstového faktoru II (IGF-II) a jejich selektivitou k receptorům inzulinové osy, (ii) specifický vazebný mechanismus domény SH3 adaptorového proteinu CAS, a (iii) strukturní podstatu vazby fosfatidylinositol 4-kinázy beta (PI4KIIIβ) na buněčnou membránu. Pro strukturní...
|
|
|
Structural studies of selected signaling protein complexes.
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Schopnost proteinů vázat jiné molekuly v reakci na různé podněty ve svém mikrookolí je základem rozsáhlých regulačních sítí, které koordinují následnou činnost buněk. Správná funkce těchto signálních drah závisí převážně na nekovalentních interakcích, které často ovlivňují strukturu proteinů a proteinových komplexů. Pochopení molekulárního mechanismu funkce proteinu v buněčné signalizaci je proto často závislé na znalosti jeho trojdimenzionální struktury. V této disertační práci představuji studie, které vedly na molekulární úrovni k pochopení několika protein-proteinových a ligand-proteinových interakcí podílejících se na buněčné signalizaci. Použila jsem nukleární magnetickou rezonanci (NMR), malo- úhlový rozptyl rentgenového záření (SAXS) a další biofyzikální metody pro určení molekulární podstaty inhibice čtyř signálních proteinů: vápník/kalmodulin (Ca2+ /CaM)- dependentní proteinkinasy kinasy 2 (CaMKK2); proteasy kaspasa-2; forkhead transkripčního faktoru FOXO3 a proteinkinasy ASK1. Konkrétněji byla zkoumána role proteinu 14-3-3 a CaM v regulaci CaMKK2 aktivity. Dále byl detailně studován mechanizmus, jakým protein 14-3-3 ovlivňuje schopnost oligomerizace a jaderné lokalizace kaspasy-2 a také byla objasněna podstata modulace transkripční aktivity FOXO transkripčních faktorů díky zkoumání...
|
|
|
Interactions in solutions and gels of stimuli-responsive polymer systems investigated by NMR spectroscopy
Konefał, Rafał ; Spěváček, Jiří (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Štěpánek, Miroslav (oponent)
Na podněty reagující (na podněty citlivé nebo inteligentní) polymery jsou polymerní materiály, které na malé vnější podněty očividně mění své fyzikální nebo chemické vlastnosti. Inteligentní polymery lze klasifikovat podle podnětů, na které reagují, jako jsou změny teploty, mechanické namáhání, ozáření světlem, aplikace ultrazvuku, aplikace vnějšího magnetického či elektrického pole, změny pH, iontové síly, přidání chemických činidel a přítomnost biomolekul či bioaktivních molekul. Na podněty reagující systémy syntetických polymerů přitahují značnou pozornost díky širokému spektru aplikací, jako jsou systémy pro řízené dodávání a uvolňování léčiv, diagnostiku, tkáňové inženýrství a "inteligentní" optické systémy, stejně jako biosenzory, mikroelektromechanické systémy, nátěry a textilie. V této disertaci byly studovány polymerní systémy reagující na teplotu, pH a reaktivní kyslík (ROS). V případě termoresponsivních polymerů, kdy jsou v dobrém rozpouštědle polymerní řetězce molekulárně rozpuštěny, se změnami teploty (zvýšení nebo pokles) dochází k teplotou- indukované fázové separaci a tvorbě globulárních nanočástic. Polymery reagující na pH mění své vlastnosti, jako jsou rozpustnost, objem (gely), konformace řetězce, jakož i vazby, které se mohou při změnách pH štěpit. ROS-responzivita může vést ke...
|
|
|
Struktura a vlastnosti modifikovaných složek nukleových kyselin
Procházková, Eliška ; Dračínský, Martin (vedoucí práce) ; Lyčka, Antonín (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Modifikované složky nukleových kyselin (nukleotidy, nukleosidy, nukleobáze) vykazují celou řadu biologických účinků, jako jsou antivirové, cytostatické, antimikrobiální nebo antioxidační. Spousta z nich je úspěšně využívána v klinické praxi, např. jako léky proti HIV nebo hepatitidě typu B. Prvním předpokladem pro studium biologických vlastností je správné určení chemické struktury a konformace studovaných látek. Pro tento účel se nejčastěji používá nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektroskopie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií. NMR spektroskopií mohou být studovány také fyzikálně-chemické vlastnosti, např. konformační změny, tautomerní formy, protonační místa, acidobazické vlastnosti, nekovalentní interakce, izotopové výměny nebo interakce s biomolekulami. Podobně jako v roztocích lze použít NMR spektroskopii pro studium složek nukleových kyselin (NACs) i v pevné fázi. Tato metoda našla své uplatnění po velkém rozmachu výpočetní chemie během posledních desetiletí. Různé struktury v pevné fázi (polymorfní formy) nebo dynamiku těchto látek lze studovat NMR spektroskopií v pevné fázi v kombinaci s kvantově-chemickými výpočty. V této práci jsem se zabývala určením struktury a fyzikálně-chemických vlastností modifikovaných NACs pomocí NMR spektroskopie v kapalné, ale i v pevné fázi v...
|
|
|
Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology
Škerlová, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
K pochopení funkce proteinu významně přispívá znalost jeho trojrozměrné struktury, obzvláště v případě komplexů s ligandy. Metody strukturní biologie, jako je rentgenová krystalografie, SAXS nebo NMR, jsou proto ve strukturní analyse interakcí proteinů s ligandy široce využívány. V této práci byly tyto metody využity k objasnění molekulární podstaty dvou biologických dějů využívajících proteinové interakce: rentgenostrukturní analysa byla použita ke studiu vazby efektorové molekuly k prokaryotnímu transkripčnímu faktoru, metody NMR a SAXS byly využity ke studiu interakce monoklonální protilátky s proteinovým antigenem. Transkripční regulátor DeoR negativně reguluje expresi katabolických genů pro utilizaci deoxyribonukleosidů a deoxyribosy v bakterii Bacillus subtilis. DeoR se skládá z N-koncové DNA-vazebné domény a z C-koncové efektor-vazebné domény (C-DeoR). Jeho funkce je regulována vazbou nízkomolekulárního efektoru deoxyribosa-5-fosfátu. Vyřešili jsme krystalové struktury C-DeoR ve volné formě a v komplexu s deoxyribosa-5-fosfátem. Strukturní analysa odhalila unikátní vazbu mezi molekulou efektoru a lysylovým zbytkem efektor-vazebného místa prostřednictvím reversibilní dvojné vazby typu Schiffovy base. Fysiologická relevance této vazby byla potvrzena mutačními experimenty a také analysou tvorby...
|
|
|
Syntéza a charakterizace nových analogů insulinu s cílem objasnit interakci insulinu s jeho receptorem
Kletvíková, Emília ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na studium insulinových analogů modifikovaných na C-konci B-řetězce s cílem sledovat vliv vložené mutace na dimerizaci insulinu a interakci s insulinovým receptorem (IR). Připraveny byly analogy s modifikacemi v pozicích B24-B26, kde byly do peptidového řetězce syntetickými a semisyntetickými metodami vloženy kódované i nekódované aminokyseliny. Studovány byly jak analogy plné délky, tak analogy zkrácené o tři až čtyři C- koncové aminokyseliny. Metodou kompetice analogu s radioaktivním (125I) lidským insulinem byla určena vazebná afinita k receptoru. Metodou isotermální titrační mikrokalorimetrie byla určena dimerizační schopnost analogů, a to zejména analogů s N- methylovanou peptidovou vazbou v pozicích B23-B24, B24-B25 a B25-B26. Metodou rentgenové krystalografie a metodou nukleární magnetické resonance byly určeny struktury vybraných analogů. Tyto struktury byly konfrontovány s vazebnou afinitou analogů s cílem charakterizovat aktivní konformaci insulinu. Charakterizovány byly analogy vykazující jak vyšší, tak i ekvipotentní či nižší vazební afinitu k IR. Výsledky krystalových struktur ukazují, že pro vazbu na receptor je důležité zachování určitého stupně ...
|
host ::
RSS.