|
|
Fenotypová analýza transgenních linií tabáku jako nástroj studia genové funkce
Srba, Miroslav ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Ovečka, Miroslav (oponent) ; Potocký, Martin (oponent)
Buněčné linie představují významný modelový systém v buněčné biologii rostlin. Dovolují jednoduché provedení cytologických analýz po nejrůznějších experimentálních ošetřeních vč. ovlivnění exprese studovaných genů. Buněčná linií tabáku BY-2 je významně upřednostňovaný model pro svoji vysokou dělivou aktivitu, schopnost efektivní synchronizace buněčného cyklu a snadnou transformovatelnost. Díky poměrně vysoké uniformitě dovoluje linie BY-2 morfologické hodnocení fenotypu na základě cytologických parametrů jako je mitotický index, viabilita, denzita a další. Předkládaná práce shrnuje zavedené metody a současné zkušenosti s prací s tabákovou linií BY-2. Jako vzorové případy hodnocení cytologických parametrů a fenotypování na buněčné úrovni jsou přeloženy vybrané výsledky dvou řešených projektů, jež byly zaměřeny na studium hybridních prolinem bohatých proteinů a na studium významu heterotrimerních G-proteinů v regulaci buněčné proliferace. V průběhu řešení těchto projektů byly optimalizovány postupy cytologického hodnocení buněčné linie BY-2. Tyto postupy zefektivňující využití tabákové linie BY-2 ve studiu genové funkce jsou v práci prezentovány.
|
|
|
Dynamika a mechanismus umlčování reportérového genu pro GFP v závislosti na aktivitě RDR6 a způsobu indukce RNA interference v buněčné linii tabáku BY-2
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent)
RNA interference (RNAi) je proces, který se u rostlin prostřednictvím malých RNA (sRNA = small RNA) významně podílí na regulaci genové exprese. Rozmanité dráhy RNAi lze rozdělit na dva základní mechanismy, a to posttranskripční a transkripční umlčování (PTGS a TGS). Vznik sRNA je vždy závislý na přítomnosti dvouvláknové molekuly RNA (dsRNA), která je štěpena některým z DCL proteinů za vzniku sRNA obvykle o délce 21 - 24 nt a jedno z vláken sRNA je následně rozpoznáno proteinem AGO. V případě PTGS interaguje komplex AGO- sRNA na základě komplementarity sekvence sRNA s cílovou RNA, kterou rozštěpí nebo zablokuje její translaci. U TGS reaguje AGO s rostlinně specifickou RNA Pol V a jejími transkripty, se kterými opět páruje vlákno sRNA nesené proteinem AGO. Tato interakce umožní sestavení komplexu proteinů, které indukují metylaci DNA a posléze i histonů, jež působí inhibičně na transkripci RNA Pol II. Způsobů, jakými může dsRNA vznikat, je celá řada. Velká část v buňce tvořených dsRNA je závislá na syntéze komplementárního vlákna do podoby dsRNA prostřednictvím RDR6 (RNA dependentní RNA polymeráza 6), která je zapojena i do procesu vzniku sekundárních sRNA. Význam RDR6 při PTGS byl zkoumán pomocí reportérového genu pro GFP, a to při samovolném umlčování a při umlčování vyvolaném třemi odlišnými...
|
|
|
Je tvorba hlíz řízena podobnými mechanismy jako kvetení?
Stupecká, Lenka ; Lipavská, Helena (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Přechod z vegetativní do generativní fáze se u rostlin nazývá kvetení. Správné načasování kvetení je zásadní podmínkou pro úspěšnou reprodukci rostlin. Kvetení je ovlivněno mnoha vnějšími a vnitřními faktory, mezi které patří délka dne neboli fotoperioda. Fotoperioda je vnímána v listech, v nichž také vzniká mobilní signál "florigen", který je transportován z listů do stonkového apikálního meristému, kde iniciuje kvetení. Fotoperiodická regulační dráha zahrnuje geny, jejichž vzájemné působení společně s působením genů z dalších regulačních drah určí dobu, kdy bude rostlina kvést. Tuberizace bramboru je důležitý morfogenetický proces, při kterém se z podzemní části stonku - stolonu - vytvářejí zásobní orgány, hlízy. Správné načasování procesu, které je nutné pro úspěšné přezimování a vegetativní množení bramboru, je řízeno jak vnitřními podmínkami, tak i vnějšími podmínkami prostředí, především teplotou, dostupností živin a fotoperiodou. Z hlediska fotoperiody působí na zakládání hlíz stimulačně krátký den. Fotoperiodická dráha kontrolující proces tuberizace má několik prvků společných s fotoperiodickou dráhou kontrolující kvetení, včetně účasti mobilního signálu - "tuberigenu". Současné výsledky ukazují, že působení jednotlivých proteinů fotoperiodické regulační dráhy může být u kvetení a...
|
|
|
Modifikace chromatinu v souvislosti s "priming" fenoménem u rostlin
Marková, Hana ; Holá, Dana (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Rostliny jsou v přirozeném prostředí vystaveny mnoha různým stresorům, kterým se musí dokázat přizpůsobit. Bylo zjištěno, že rostliny si mohou "zapamatovat" předchozí stresovou odpověď a na následné vystavení stejnému stresoru zareagovat rychleji a ve větší míře. Jedním z předpokládaných mechanismů tohoto tzv. "primingu" by mohly být změny na úrovni chromatinových modifikací. Modifikace chromatinu se zpravidla v průběhu stresové reakce dynamicky mění. Některé změny by však mohly zůstat trvalé, čímž by se vytvořila specifická, meioticky nebo mitoticky transmisibilní "stresová paměť". V případě mitoticky transmisibilní "stresové paměti" byl takový jev zatím pozorován u stresu v důsledku dehydratace, zasolení, mechanického poškození, kombinace různých stresorů a systémové rezistence na patogenní bakterie. Zatím se jedná jen o několik málo studií; už teď se ale ukazují rozdíly v reakci konkrétních genů, stejně jako závislost na délce stresového stimulu a délce period mezi prvním a druhým stresem. Velkým nedostatkem dosavadních studií je jejich zaměření pouze na histonové modifikace. Nicméně v rámci dosud studovaných chromatinových modifikací se zdá, že jako hlavní značka pro "priming" by mohla sloužit převážně H3K4me3. Naproti tomu modifikace H3K27me3 zřejmě jako "paměťová značka" neslouží. Na vyvození...
|
|
|
Specifické funkce podjednotek ARP2/3 komplexu
Fišerová, Kamila ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Oulehlová, Denisa (oponent)
Aktin je jedním z nejrozšířenějších proteinů v živých organismech. Regulaci aktinového cytoskeletu zajišťuje mnoho mechanismů, jedním z regulátorů dynamiky aktinu u rostlin i živočichů je vysoce konzervovaný - Arp2/3 komplex. U všech organismů je tvořen dvěma velkými podjednotkami (Arp2 a Arp3) a pěti malými podjednotkami (ArpC1- ArpC5). Arp2/3 komplex řídí větvení aktinových filament v úhlu 70o . V předložené práci jsou popsány funkce jednotlivých podjednotek se zvláštním důrazem na ty, které jsou pro jednotlivé podjednotky specifické. Vytvořený souhrn překračuje hranice rostlinné říše a věnuje se i živočichům a kvasinkám, u kterých je tento komplex aktivně zkoumán, a je dostupná řada informací o mechanismech jeho regulace. V práci jsou shrnuty vzájemné interakce mezi podjednotkami i jejich interakce s regulátory Arp2/3 komplexu a dalšími proteiny. Některé z podjednotek jsou u některých organismů kódovány i více než jedním genem, v takových případech mohou mít tyto izoformy i rozdílné funkce. Arp2/3 komplex je pro živočichy nezbytný k životu, u rostlin mají však mutace v podjednotkách tohoto komplexu mírnější projevy. V rostlinách se Arp2/3 komplex uplatňuje především v rychlém a orientovaném růstu, mutace podjednotek se proto projevují typickým poškozením trichomů. Klíčová slova - Arp2/3 komplex,...
|
|
|
Glutamin syntetázy a jejich role v metabolismu dusíku v prýtu rostlin
Kobercová, Eliška ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Tylová, Edita (oponent)
Glutamin syntetáza je klíčový enzym pro asimilaci amonných iontů a biosyntézu glutaminu v rostlinách. Amonné ionty jsou důležitým meziproduktem metabolismu dusíku, ve zvýšené koncentraci jsou však pro rostlinu toxické. Správné fungování glutamin syntetázy je pro rostlinu životně důležité - glufosinát, specifický inhibitor glutamin syntetázy, účinkuje jako totální herbicid. Glutamin syntetáza se uplatňuje v řadě významných metabolických procesů: při primární asimilaci dusíkatých živin, při reasimilaci amonných iontů během fotorespirace či metabolismu fenylpropanoidů a při remobilizaci dusíku při tvorbě semen, během klíčení nebo senescence. Podle lokalizace v buňce se glutamin syntetázy krytosemenných rostlin dělí na plastidovou (GS2), která je kódována zpravidla jedním genem, a na cytosolickou (GS1), kterou kóduje rodina několika genů. Jednotlivé isoformy glutamin syntetáz mají rozdílnou lokalizaci v rámci rostlinných orgánů a pletiv, liší se způsobem regulace a úlohou v metabolismu dusíku. Klíčová slova: plastidová a cytosolická glutamin syntetáza, asimilace amonných iontů, metabolismus dusíku, fotorespirace
|
|
|
Izolace a charakterizace genu pro lakázu u ječmene (Hordeum vulgare L.)
Drábková, Lenka ; Kučera, Ladislav (vedoucí práce) ; Čurn, Vladimír (oponent) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Lakázy jsou jedněmi z prvních studovaných enzymů. Poprvé se o lakáze zmínil Yoshida ve své publikaci v roce 1883 (Yoshida H, 1883). Lakázy (EC 1.10.3.2, p-difenol-O2 oxidoreduktáza), mezi které lze i zařadit LMCO, jsou enzymy obsahující měď a jsou součástí větší skupiny enzymů nazývané polyfenoloxidázy. Lakázy katalyzují oxidaci širokého spektra substrátů, např. polyfenoly, substituované fenoly, diaminy, ale i některé anorganické sloučeniny za současné redukce kyslíku na vodu. Zdrojem elektronů v těchto redoxních reakcích jsou u těchto enzymů obvykle čtyři atomy mědi. Lakázy hub, které jsou dosud nejvíce studovanou skupinou, jsou známé pro svoji roli v odbourávání ligninu, bioremediaci, morfogenezi a patogenitě. Navzdory mnoha letům výzkumu, fyziologické funkce lakáz v rostlinách zůstávají velkou neznámou. Předpokládá se, že rozhodující úlohu hrají lakázy u rostlin při lignifikaci. Podílí se hlavně na syntéze ligninu, udržení integrity buněčné stěny a její struktury a na hojení ran. Lakázy mohou katalyzovat širokou škálu enzymatických reakcí a mají patrně svou úlohu v rámci reakce rostlin na stres. Lakázy rostlin byly popsány zejména u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana), u kukuřice (Zea mays) a u rýže seté (Oryza sativa). U dalších hospodářsky významných rostlin nebyla lakáza zatím...
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
Transformace lilku bramboru genem kódujícím proteázový inhibitor SPI-2
Říhová, Barbora ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Vítámvás, Pavel (oponent)
Předmětem této diplomové práce byla genetická modifikace lilku bramboru za účelem zvýšení jeho rezistence vůči patogenům a škůdcům. Při vývoji rezistence rostlin se často využívá podobných typů molekul, které rostliny samy využívají při svých obranných reakcích. V této práci byl pro genetickou modifikaci použit gen kódující zástupce inhibitorů serinových proteáz SPI-2, pocházející ze zavíječe voskového (Galleria mellonella). Jelikož se v předchozích pokusech týmu protein SPI-2 nepodařilo v transformovaných rostlinách detekovat, byla základní forma genu upravena přidáním Kozakové sekvence do okolí iniciačního kodónu, čímž se měla zvýšit iniciace translace a tím hladina proteinu. Pro transformaci byly připraveny dva konstrukty, kódující proteiny SPI-2-T a SPI-2-Y, které se liší jednou aminokyselinou, a to mírně pozměňuje jejich inhibiční aktivitu. Konstrukt SPI-2-T byl nejprve pomocí infiltrace s Agrobacterium tumefaciens vnesen do listů tabáku Nicotiana benthamiana. Oba konstrukty SPI-2-T a SPI-2-Y byly poté použity pro stabilní transformaci lilku bramboru (Solanum tuberosum cv. Desireé). Přítomnost proteinu se však v rostlinách nepodařilo prokázat, přestože byl vnesený gen transkribován a jeho sekvence v rostlinách byla ověřena sekvenací. Je tedy pravděpodobné, že protein není v cytoplazmě...
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
host ::
RSS.