|
|
Biochemické změny při stárnutí červeného vína
Vacková, Tereza ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Flavonoidy jsou rostlinné sekundární metabolity, které se dělí do několika skupin podle chemické struktury. Důležitými složkami vína, které jsou zodpovědné za jeho barvu, chuť a další senzorické vlastnosti, jsou barevné pigmenty - anthokyany a taniny (třísloviny). Koncentrace anthokyanů ve víně je ovlivněna odrůdou, zpracováním hroznů a klimatickými podmínkami. Ke studiu změny barvy a tím i souvisejícího chemického složení, byly použity tři nekomerční vzorky červeného vína, Svatovavřinecké, ročník 2010 a 2012, a domácí víno bez přidaného SO2. Ke stanovení barevných změn byly použity převážně kolorimetrické (metoda CieLab) a zjednodušené spektrofotometrické metody (barevná hustota a odstín). Množství anthokyanů bylo sledováno analytickou metodou RP-HPLC. Koncentrace fenolických látek byla stanovena upravenými enologickými metodami. Během stárnutí vína došlo k barevným změnám, které byly způsobeny polymerizačními reakcemi, které probíhají mezi anthokyany a fenolickými sloučeninami. To vedlo ke vzniku stabilních barevných pigmentů, které se projevily vyšším absorpčním maximem a tedy i tmavším zabarvením. Klíčová slova: anthokyany, barva, červené víno, fenolické sloučeniny, malvidin-3-glukosid, polymerizační reakce, pigmenty.
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Biotransformace fenolických látek enzymovými systémy kvasinky Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni
Vilímková, Lenka ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Mareš, Jaroslav (oponent)
Kvasinka Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni se vyznačují schopností využívat fenol jako jediný zdroj uhlíku a energie. V naší laboratoři se zabýváme zejména studiem cytoplasmatických enzymů zodpovědných za první a druhý krok odbourání fenolu: NADPH-dependentní fenolhydroxylasy C. tropicalis i C. testosteroni a katechol 1,2- dioxygenasy C. tropicalis. Cílem naší práce je izolovat a částečně charakterizovat tyto enzymy. Fenolhydroxylasa C. tropicalis byla purifikována použitím následující kombinace metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, frakční precipitace polyethylenglykolem 6000 a gelové permeační chromatografie na Sephacrylu S-300. Extracelulární fenolhydroxylasa C. testosteroni byla získána frakční precipitací kultivačního média polyethylenglykolem 6000 a gelovou permeační chromatografií na 4B Sepharose a Sephacrylu S-300. Katecholdioxygenasa byla z cytosolu C. tropicalis izolována za použití metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, lyofilizace enzymového preparátu a gelové permeační chromatografie na Sephadexu G-100 Enzymová aktivita byla měřena buď pomocí HPLC nebo spektrofotometricky. Čistota enzymů byla sledována elektroforézou SDS-PAGE. Molekulová hmotnost enzymů byla určena pomocí...
|
|
|
Připrava slepičích protilátek proti fosfoserinovym zbytkům fosfoproteinu
Benýšek, Jakub ; Tichá, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Byl připraven nový typ imunogenu pro přípravu slepičích protilátek specifických pro O-fosforylované aminokyselinové zbytky fosfoproteinů: směs fosfopeptidů α-kaseinu imobilizovaná na maleylovaný derivát hovězího serového albuminu. Pro separaci fosfopeptidů α-kaseinu ze směsi peptidů po štěpení proteinu trypsinem byla použita afinitní chromatografie na imobilizovaných železitých iontech (Fe(III)-IDA-Sepharosa). Separovaná frakce fosfopeptidů α-kaseinu byla navázána na maleylovaný derivát hovězího seérového albuminu. Přítomnost navázaných fosfopeptidů byla prokázána pomocí MALDI-TOF MS analýzy. Po imunizaci slepic připraveným imunogenem, byla ze žloutků izolována imunoglobulinová frakce, která dále byla purifikována pomocí afinitní chromatografie na α-kasein-Sepharose a na hovězím sérovém albuminu imobilizovaném na Sepharose (BSA-Sepharosa). Specifita získaných protilátek byla testována pomocí ELISA testů. Bylo zjištěno, že připravené slepičí protilátky, ani jejich frakce po afinitní chromatografii na α-kasein-Sepharose O-fosforyl-O- serinový zbytek v modelových fosfoproteinech (α-kasein, fosvitin, ovalbumin) nerozpoznávají. Pomocí synteticky připravených antigenů bylo prokázáno, že slepičí protilátky připravené imunizací antigenem vázaným na maleylovaný nosný protein rozpoznávají přítomnost...
|
|
|
Eukaryotic and prokaryotic nitric oxide synthase - structure-function studies
Mikula, Ivan ; Martásek, Pavel (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Král, Vladimír (oponent)
Oxid dusnatý (NO) patří mezi nejdůležitější signální molekuly organismů, kde hraje zásadní roli v širokém spektru fyziologických a patologických procesů, včetně vazodilatace, přenosu nervového signálu a imunitní odpovědi organismu. Tato plynná molekula je produktem oxidační reakce katalyzované rodinou syntáz oxidu dusnatého (NOS).U savců byly identifikovány tři izoformy NOS, endoteliální (eNOS), neuronální (nNOS) a inducibilní, nebo také imunologická (iNOS). Některé bakterie nesou geny kódující proteiny homologní s oxygenázovou doménou savčích NOS a vykazující NO-syntázovou aktivitu in vitro. Předpokládá se, že NO tvořený patogenními organismy jako je B. anthracis nebo S. aureus by mohl hrát kritickou roli v patofyziologickém průběhu infekce. Komparativní studie bakteriálních "NOS-like" enzymů a savčích NOS prokázala jejich základní podobnost a zároveň rozdíly mezi jednotlivými bakteriálními proteiny i savčími izoformami při interakcích s různými analogy substrátu L-argininu a dalšími ligandy. Na základě výsledků měření kinetiky zpětné vazby NO byla predikována přítomnost druhého NO-vazebného místa v aktivním centru některých NOS. Dále byla popsána regulace dynamiky a uvolňování NO z proteinu NOS pomocí sítě vodíkových vazeb mezi hemovou prostetickou skupinou, substrátem a kofaktorem BH4. Nitrity (NO2 -)...
|
|
|
Metabolismus karcinogenního o-nitroanisolu a jeho metabolitu o-nitrofenolu a environmentalních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu
Svobodová, Martina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOCHEMIE Metabolismus karcinogenního o-nitroanisolu, jeho metabolitu o-nitrofenolu a environmentálních polutantů 2-nitrobenzanthronu a 3-nitrobenzanthronu Autoreferát disertační práce RNDr. Martina Svobodová Školitelka: Prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc. Praha 2010 RNDr. Martina Svobodová Úvod -1- ÚVOD 2-Nitroanisol 2-Nitroanisol (2-methoxynitrobenzen, 2-NA, obrázek 1) je významný průmyslový polutant a silný karcinogen vyvolávající u myší a potkanů tvorbu nádorů močového měchýře, v menší míře také nádory sleziny, jater a ledvin [19, 30, 31] . Tato sloučenina má také toxické účinky a způsobuje anémii. 2-NA je primárně používán jako prekursor při výrobě o-anisidinu (2-methoxyanilinu), intermediátu, který je dále využíván v barvářském průmyslu při výrobě azobarviv. Rovněž je využíván ve farmaceutickém průmyslu jako meziprodukt při syntéze některých léčiv [30, 31] . Navzdory tomu, že 2-nitroanisol je silným karcinogenem pro hlodavce, vykazuje jen slabou mutagenní aktivitu v Amesově testu pro kmen Salmonella typhimurium. Tato karcinogenní látka vykazuje též nízkou aktivitu v cytogenetických testech. Indukuje nepatrný nárůst chromosomálních aberací a sesterských chromatidových výměn, ale pouze při vysokých koncentracích [31] . 2-Nitroanisol může být...
|
|
|
Gangliosidy v játrech u cholestázy indukované podvázáním žlučovodu.
Hynková, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Ledvinová, Jana (oponent)
Gangliosidy patří mezi sfingolipidy obsahující kyselinu sialovou. Nachází se na buněčném povrchu všech typů živočišných buněk. Zde plní funkci receptorových molekul, dále se účastní mezibuněčných interakcí a díky své rigidní struktuře zpevňují buněčnou membránu a chrání tak buňku před škodlivými okolními vlivy. Tato diplomová práce studuje vliv experimentální cholestázy na složení gangliosidů jaterní tkáně. Cholestáza byla vyvolána podvazem žlučovodů u potkanů kmene Wistar. V játrech zvířat s cholestázou ve srovnání s kontrolami byl zjištěn signifikantní nárůst celkové lipidní kyseliny sialové a gangliosidů b-série (GD1b, GT1b event. GD3). Tyto výsledky zjištěné u obstrukční cholestázy odpovídají výsledkům které publikoval Majer a spol. Biomed. Chromatogr., 21, 446-450 (2007) u cholestázy vyvolané 17-α− ethinylestradiolem, ale nárůst gangliosidů b-série je v naší studii mírnější. Dále tato práce zkoumala vliv modulace aktivity hemoxygenasy 1 (HO-1) při cholestáze vyvolané podvazem žlučovodů (hemin jako aktivátor HO-1, Sn-mesoporfyrin jako inhibitor HO-1) na složení gangliosidů. U skupin zvířat s podávaným Sn-mesoporfyrinem bylo zjištěno zvýšení celkové kyseliny sialové, zatímco u některých gangliosidů a- i b- větve byl zjištěn pokles. U skupin zvířat s heminem aktivovanou HO-1 byla zvýšená celková...
|
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
|
|
Subcelulární lokalizace a úloha komplexu exocyst v savčích buňkách během cytokineze
Ulrychová, Lenka ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Posledním krokem buněčného cyklu je cytokineze. Během ní dojde k oddělení dvou dceřiných buněk. Tohoto procesu se účastní množství membránových struktur jako jsou endoplazmatické retikulum a trans-Golgi komplex. Kromě toho je v posledních letech stále více zdůrazňována úloha recyklačních endozomů. Všechny tyto organely spolu vzájemně komunikují pomocí vnitrobuněčného transportu, který je velice důležitý pro úspěšný průběh cytokineze zejména z pohledu nově vznikající plazmatické membrány oddělujících se dceřinných buněk. Nedávné studie odhalily, že tato membránová dynamika je regulována tzv. malými GTPázami z proteinové nadrodiny Ras. Další proteiny s významnou úlohou během membránového transportu jsou takzvané poutací komplexy, které směrují příslušné vnitrobuněčné komponenty k cílové plazmatické membráně, kde usnadňují vzájemnou fúzi. Nejlépe prozkoumaným poutacím komplexem je exocyst komplex. Jeho přítomnost byla prokázána ve všech typech eukaryotních buněk. Tento proteinový komplex je složený z osmi podjednotek Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 a Exo84. Ačkoliv přesný mechanizmus zůstává neznámý, zdá se, že dochází k interakcím mezi podjednotkami exocyst komplexu a zástupci Ras rodiny proteinů. Je proto možné, že se tyto proteiny podílejí na regulaci transportu vnitrobuněčných váčků...
|
|
|
Characterization of the role of SPINK 6 in the epidermis using transgenic models
Buryová, Halka ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Epidermis tvoří bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím, přičemž celková homeostáze je závislá mezi jiným i na správné obměně keratinocytů. Podstatnou úlohu hrají v tomto procesu serinové proteázy a jejich inhibitory. Aktivované proteázy štěpí desmosomy ve svrchní vrstvě epidermis a umožňují tak odlupování keratinocytů. V nižších vrstvách epidermis jsou proto vylučovány proteázové inhibitory, jejichž funkcí je zabránit předčasné aktivaci proteáz, a tím rozrušení epidermální bariéry. Mezi nejznámější inhibitory v epidermis patří inhibitory serinových proteáz kazálního typu (SPINK). Tato práce je orientována na výzkum myšího SPINK6 in vivo. K tomu účelu jsme pomocí modifikovaného lidského involukrinového promotoru vytvořili transgenní myši exprimující mSPINK6 ve zvýšené míře, přičemž vyšší expresi mSPINK6 na mRNA a proteinové úrovni RNA vykazovaly dvě z pěti trasngenních linií. Ukázali jsme, že transgenní zvířata jsou životaschopní jedinci bez zjevného fenotypového projevu. Na makroskopické úrovni jsme pak popsali mírný fenotyp, který odlišuje transgenní mSPINK6 myši od normálních jedinců. Závěrem lze říci, že mSPINK6 hraje v homeostázi kůže nejspíš pouze minoritní roli, naproti tomu však může být velmi důležitý při specifické obměně epidermální bariéry. Námi připravené mSPINK6 trasngenní myši mohou být...
|
host ::
RSS.