Název:
Připrava slepičích protilátek proti fosfoserinovym zbytkům fosfoproteinu
Překlad názvu:
Preparation of chicken antibodies against phosphoserine residues of phosphoproteins
Autoři:
Benýšek, Jakub ; Tichá, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) Typ dokumentu: Diplomové práce
Rok:
2012
Jazyk:
cze
Abstrakt: [cze][eng] Byl připraven nový typ imunogenu pro přípravu slepičích protilátek specifických pro O-fosforylované aminokyselinové zbytky fosfoproteinů: směs fosfopeptidů α-kaseinu imobilizovaná na maleylovaný derivát hovězího serového albuminu. Pro separaci fosfopeptidů α-kaseinu ze směsi peptidů po štěpení proteinu trypsinem byla použita afinitní chromatografie na imobilizovaných železitých iontech (Fe(III)-IDA-Sepharosa). Separovaná frakce fosfopeptidů α-kaseinu byla navázána na maleylovaný derivát hovězího seérového albuminu. Přítomnost navázaných fosfopeptidů byla prokázána pomocí MALDI-TOF MS analýzy. Po imunizaci slepic připraveným imunogenem, byla ze žloutků izolována imunoglobulinová frakce, která dále byla purifikována pomocí afinitní chromatografie na α-kasein-Sepharose a na hovězím sérovém albuminu imobilizovaném na Sepharose (BSA-Sepharosa). Specifita získaných protilátek byla testována pomocí ELISA testů. Bylo zjištěno, že připravené slepičí protilátky, ani jejich frakce po afinitní chromatografii na α-kasein-Sepharose O-fosforyl-O- serinový zbytek v modelových fosfoproteinech (α-kasein, fosvitin, ovalbumin) nerozpoznávají. Pomocí synteticky připravených antigenů bylo prokázáno, že slepičí protilátky připravené imunizací antigenem vázaným na maleylovaný nosný protein rozpoznávají přítomnost...New type of immunogen for the preparation of chicken antibodies specific for O- phosphorylated amino acid residues of phosphoproteins was prepared: the α-casein phosphopeptide mixture was coupled to maleinylated derivative of bovine serum albumin. Affinity chromatography on immobilized Fe(III) ions (Fe(III)-IDA-Sepharose) was used for the separation of the α-casein phosphopeptide fraction from the α-casein peptide mixture obtained by the proteolytic digestion using trypsin. The presence of coupled phosphopeptide was shown by means of MALDI-TOF MS analysis. After chicken immunisaion with the prepared immunogen the immunoglobulin fraction was isolated from egg yolks that was further purified using affinity chromatography on α-casein-Sepharose and bovine serum albumin immobilized on Sepharose (BSA-Sepharose). The specificity of obtaine immunoglobulin fractions was tested by means of ELISA tests. The obtained results showed, that the prepared chicken antibodies and their fractions obtained by affinity chromatography on α-casein-Sepharose do not recognize the O-fosforyl-L-serine residues of phosphoproteins (α-casein, phosvitin, ovalbumin). Using the prepared different antigens it has been shown, that prepared chicken antibodies interact with maleinylated chain coupled to carrier proteins. .