|
|
Molecular mechanisms of amoeboid invasion of cancer cells
Paňková, Daniela ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Dvořák, Michal (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
IN CZECH Invasivita nádorových buněk je jedním z nejdůležitějších kroků v procesu maligní progrese. Je charakterizovaná širokým spektrem mechanismů, které zahrnují jak individuální, tak kolektivní migrací buněk. Během procesu invasivity se nádorové buňky šíří do okolních tkání, kde zakládají nové metastázy. I proto je pochopení mechanismů buněčné invasivity zásadním krokem k účinné protinádorové terapii. Individuálně migrující buňky vykazují ve 3D prostředí dva způsoby invasivity. Mesenchymalně invadující buňky produkují během své migrace proteázy, které využívají k degradaci kolagenových vláken. Studie srůznými typy nádorových buněk zaměřené na inhibici proteáz poukázaly na nový amoeboidní mechanizmus invasivity buněk, který není závislý na degradací extracelulární matrix pomocí proteáz. Během mé disertační práce jsem se zaměřila na studium molekulárních mechanismů uplatňujících se v amoeboidní invasivitě nádorových buněk. Pro naše experimenty jsme využili potkaní sarkomový model sestávající z parentální nemetastazující linie K2 a od ní odvozené vysoce invasivní linie A3. Ukázali jsme, že i když je vysoce metastatická sarkomová linie A3 buněk mesenchymálního původu, její invasivní vlastnosti jsou závislé na upregulaci Rho / ROCK signální dráhy, která vede ke generování protrusivních sil na...
|
|
| |
|
|
The biological importance of CAS SH3 domain tyrosine phosphorylation
Janoštiak, Radoslav ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Dvořák, Michal (oponent)
Proteín CAS je hlavný tyrozín-fosforylovaný proteín v bunkách transformovaných virovými onkogénmi v-src a v-crk. Je to multidoménový adaptorový proteín slúžiaci ako lešenie pre zostavovanie signálnych komplexov dôležitých pre migráciu a invazivitu Src-transformovaných buniek. V N-koncovej SH3 doméne proteínu CAS bolo identifikované nové fosforylačné miesto - tyrozín 12 nachádzajúci sa na väzbovom povrchu SH3 domény. Pre štúdium biologického významu fosforylácie tyrozínu 12 boli pripravené nefosforylovateľná ( Y12F ) a fosfomimikujúca ( Y12E ) mutanta proteínu CAS. Zistili sme, že fosfomimikujúca mutácia Y12E znižuje asociáciu s kinázou FAK a fosfatázou PTP-PEST a taktiež znižuje tyrozínovú fosforyláciu kinázy FAK. Pomocou GFP značeného proteínu CAS sme následne zistili, že Y12E mutácia delokalizuje proteín CAS z fokálnych adhézií, pričom však nemá žiadny vplyv na lokalizáciu CAS do podozómov. Nefosforylovateľná mutácia Y12F zapríčiňuje hyperfosforyláciu substrátovej domény CAS a znižuje dynamiku fokálnych adhézií a s tým spojenú migračnú kapacitu myších embryonálnych fibroblastov ( MEF ) nezávisle na integrínovej signlizácii. Analogicky k migrácii, CAS Y12F znižuje i invazivitu Src-transformovaných MEF. Z výsledkov tejto diplomovej práce vyplýva dôležitosť fosforylácie Tyr 12 v SH3 doméne CAS pre...
|
|
|
Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families
Čermák, Vladimír ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Regulace transckripce desítek tisíc genů v organizmu obratlovců je mimořádně komplexním fenoménem, jehož se účastní tisíce různých regulačních proteinů. Největší funkční kategorií těchto regulátorů jsou sekvenčně specifické DNA vazebné proteiny známé jako transkripční faktory. Proteiny z EGR a Myb rodin transkripčních faktorů jsou relativně dlouho zkoumanými regulátory různých fyziologických procesů, včetně buněčné proliferace a diferenciace. Zatímco strukturální a fyzikální aspekty jejich funkce byly dobře charakterizovány, jejich buněčně specifická role v komplexních genově regulačních sítích není dostatečně prostudována a představuje hlavní výzvu v příslušných oblastech výzkumu. Předběžná analýza dat genové exprese z metastázujících buněk PR9692 a nemetastázujících buněk PR9692-E9 (kuřecích sarkomové linie) odhalila, že transkripční faktor EGR1 je syntetizován v relativně větším množství v metastázujících buňkách a může se tak podílet na regulačních procesech, které jsou základem rozdílů mezi oběma buněčnými liniemi. Dalším zkoumáním jsme zjistili, že cílené zvýšení hladiny EGR1 v PR9692-E9 buňkách obnovuje jejich metastatický potenciál na úroveň PR9692 buněk. Mikročipová analýza takových buněk odhalila aktivaci genů, které jsou rozhodující pro kontraktilitu aktinového cytoskeletu (MYL9),...
|
|
| |
|
|
Využití testu CAM pro charakterizaci a studium invazivních vlastností rakovinných buněk
Vágnerová, Lenka ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Geryk, Josef (oponent)
Kuřecí chorioalantoidální membrána (CAM) je jedním z nejčastěji využívaných in vivo modelových systému pro studium angiogeneze a buněčné invazivity. V rámci této práce byly na CAM testovány vybrané kuřecí sarkomové linie zkoumané v naší laboratoři, u nichž došlo ke změně angiogenních vlastností a schopnosti tvořit metastázy. Kromě CAM testu byl fenotyp těchto buněk charakterizován pomocí několika dalších metod. Vytipovali jsme několik proteinů, které by u zkoumaných buněk mohly ovlivnit změnu jejich angiogenních a invazivních vlastností, a vytvořili jsme stabilně transfekované buněčné linie, které jsme porovnávali s původními buňkami. Prokázali jsme, že geny kódující proteiny ISL1, ARNT2, PROM1, HOXA11 se v našem experimentálním modelu podílejí na aktivaci programů angiogeneze a buněčné invazivity.
|
|
|
Genová exprese v kuřecím embryu: mikromanipulační a vizualizační metody
Bendová, Michaela ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Cílem této dizertační práce bylo získat lepší vhled do principů vývoje buněčných struktur a orgánů v kuřecím embryu. K tomuto účelu byly zavedeny a k daným procedurám upraveny různé pokročilé metody manipulace a vizualizace in vitro, ex vivo, ex ovo a in ovo. Tyto specializované metody byly využity zejména ke studiu genové exprese ve vývoji neurální lišty a vývoji oka. Během dlouhodobého výzkumu v naší laboratoři byl pozorován vliv onkoproteinu v-Myb na vývoj neurální lišty a jeho schopnost měnit přirozený buněčný osud. Studovali jsme vliv proteinu v-Myb na změny v diferenciaci buněk neurální lišty, zejména jejich vývoj do melanocytární linie, a jeho vliv na expresi genů v neurální liště. Středem našeho zájmu se stal protein Gremlin 2, označovaný také jako PRDC (protein related to Dan and Cerberus), jehož expresi v-Myb v neurální liště zvyšuje. Zavedené postupy elektroporace neurální lišty in ovo byly upraveny pro transfekci buněk vyvíjejícího se oka a využity ke studiu genové regulace při indukci čočky. Výsledky získané na kuřecím modelu podpořily studii provedenou na myších embryích. Technika elektroporace do embryonálního oka byla také upravena pro mikromanipulace s retinou in ovo, která byla dále zpracována metodami ex vivo a in vitro pro studii zabývající se lokalizací snRNP ve...
|
|
|
Cytokine expression in chemically-induced senescence
Nováková, Zora ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Hampl, Aleš (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Souhrn Buněčná senescence, kerá dokáže potlačit nádorové bujení, představuje odpověď buněk na stres a poškození DNA a způsobuje zástavu proliferace. Na tomto ději se zřejmě podílejí i produkované cytokiny. V současné době se mnoho vědeckých skupin snaží stanovit povahu a funkci sekrečního fenotypu spojeného se senescencí. Bylo zjištěno, že prozánětlivé látky sekretované senescentními buňkami ovlivňují okolní buňky i své vlastní producenty. Tyto poznatky byly získány především na modelech replikativní a onkogenem indukované senescence. Úkol této práce spočíval v definování cytokinové produkce senescentními buňkami indukovanými genotoxickými látkami bromodeoxyuridinem a distamycinem A. V tomto modelu jsme zjistili trvale aktivovanou interferonovou signalizaci spojenou se zvýšením interferonových cílových genů zahrnujících PML, STAT1 a IRF1. Při testování více než 160 cytokinů a jejich receptorů jsme nalezli zvýšenou hladinu u více než dvaceti cytokinů zahrnující prozánětlivé faktory IL-1, IL-6 and IL-8. Domníváme se, že cytokinová signalizace spojená se senescencí vyvolavou chemikáliemi představuje složitý a robustní děj, který je udržován pozitivními zpětnými vazbami. Charles University in Prague Faculty of Sciences PML (promyelocytární leukemický protein) a PML tělíska hrají roli v potlačování...
|
|
|
Studium extracelulárních nukleových kyselin v mateřské cirkulaci u patologické a fyziologické gravidity
Žejšková, Lenka ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Černá, Marie (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Objev fetální extracelulární DNA v mateřské cirkulaci v roce 1997 přispěl k vývoji nových metod neinvazivní prenatální diagnostiky, které patří mezi nejmodernější přístupy péče o matku a plod. Do rutinní praxe byla zavedena vyšetření pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění a kongenitální adrenální hyperplazie a Rh faktoru plodu u aloimunizovaných gravidit. Tato dizertační práce se zabývá základní charakteristikou extracelulární fetální DNA a fetálních buněk v mateřské cirkulaci a jejich využitím pro neinvazivní prenatální diagnostiku, zejména u gravidit s patologickou placentací (preeklampsie, IUGR). U těchto těhotenských komplikací bylo zjištěno, že v důsledku nedostatečné transformace mateřských spirálních arterií dochází k ischemii a zvýšené apoptóze placentárního trofoblastu a následně ke zvýšenému uvolňování extracelulárních nukleových kyselin (fetálního a mateřského původu) do cirkulace. Doposud byly kvantifikační studie omezeny pouze na gravidity s mužským pohlavím plodu s využitím detekce specifických sekvencí nacházejících se na Y chromozomu (SRY, DYS-14). Vědci se proto snažili objevit tzv. "univerzální fetální marker", který by mohl být využit pro kvantifikační studie zabývající se aktuálním funkčním stavem placenty, nezávisle na pohlaví plodu. Jednou z možností je...
|
|
| |
host ::
RSS.