|
|
Experimental verification of in silico predicted protein binder to FOXO4 transcription factor and transcriptome analysis of bladder cancer
Tauš, Petr ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Tato diplomová práce je rozdělená na experimentální a bioinformatickou část, které jsou spolu provázány přes transkripční faktory z rodiny 'forkhead box O' (FOXO). FOXO mají klíčovou roli v mnoha buněčných procesech, jako například v regulaci buněčného cyklu, apoptózy a metabolismu. Dlouhou dobu byly považovány pouze za nádorové supresory, ale vzrůstající počet studií poukazuje i na jejich pronádorovou roli. Z tohoto důvodu jsou intenzivně studovány jako potenciální terapeutické cíle v nádorových onemocněních. In silico predikce protein-protein interakcí se v poslední dekádě těší vzrůstající oblibě jak v základním výzkumu, tak při vývoji nových léčiv. Nicméně výsledky v mnoha případech stále nejsou dostatečně přesné při srovnání s očekávanými vlastnostmi predikovaných biomolekul. V této práci jsem pomocí termoforézy v malém měřítku ověřil vazbu čtyř in silico predikovaných vazebných proteinů, založených na přirozeně se vyskytující PDZ doméně k transkripčnímu faktoru FOXO4. Neinvazivní nádory močového měchýře představují heterogenní onemocnění, u kterého se i přes veškeré snahy stále nedaří přesně predikovat agresivita daného nádoru. V bioinformatické části této práce jsem na základě transkriptomických dat z pacientských vzorků nádorů močového měchýře popsal složení nádorového mikroprostředí a určil...
|
|
|
Měření aktivace signálních drah v myší makrofágové linii IC-21 a primárních dendritických buňkách po infekci virem klíšťové encefalitidy.
Kožantová, Jana ; Lieskovská, Jaroslava (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Klíšťová encefalitida je závažným onemocněním centrální nervové soustavy. Je způsobena virem klíšťové encefalitidy, který je přenášen klíšťaty. Česká republika patří mezi země s největším výskytem této nemoci. Virus klíšťové encefalitidy je schopen se replikovat v několika buněčných typech. V práci jsme se zaměřili na makrofágovou linii IC-21 a dendritické buňky, protože jsou to jedny z prvních buněk přicházejících do kontaktu s virem a zároveň napomáhají šíření viru v hostiteli v počáteční fázi infekce. Dosud není znám specifický receptor pro vstup viru do buňky, ani které signální dráhy aktivuje. Proto jsme se rozhodli prozkoumat aktivaci vybraných signálních drah po infekci virem klíšťové encefalitidy a ovlivnění této aktivace klíštěcími slinami. K tomuto účelu byly využity metody duální luciferázové eseje, imunosendvičové eseje a western blotu. Ze získaných výsledků vyplývá, že ve virem infikovaných buňkách IC-21 se aktivuje fosfatidyl-inositolová dráha, NF-κB, signální molekula Erk1/2 a další. Testování vlivu klíštěcích slin ukázalo, že jejich účinkem dochází k signifikantnímu snížení aktivity signálních molekul NF-κB, AP-1 a CREB.
|
|
|
Regulatory mechanisms of CD47 surface expression
Jakubec, Martin ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Dibus, Michal (oponent)
Glykoproteín CD47 najdeme na povrchu všech zdravých typů buněk v našem těle. Díky jeho interakci s povrchovým proteinem makrofágů, receptorem SIRPα, má protein CD47 nenahraditelnou úlohu v bezpečném rozeznávání buněk organismu vlastních. Tato interakce má za následek inhibici fagocytózy dané buňky makrofágem. Kromě této interakce hraje CD47 také klíčovou roli ve zprostředkování celé řady esenciálních signálních drah, pro příklad buněčnou adhezi a mobilitu či vápníkovou homeostázu. Míra exprese proteinu CD47 a jeho přítomnost v membráně se mění v závislosti na typu tkáně nebo věku buňky. V buňkách, podstupujících nádorovou transformaci, pozorujeme opětovné zvýšení exprese receptoru CD47, které kromě jiného napomáhá uniknutí imunitnímu dozoru makrofágů, a tedy přežívání těchto buněk. Přirozená regulace genu kódujícího protein CD47 je způsobena regulačními transkripčními faktory, jako jsou například NF-κB či HIF-1. Další z mechanismů regulace exprese CD47 zahrnuje 3'UTR transkriptu, která slouží jako vazbové místo pro regulační proteiny, pro příklad HuR, nebo pro malé RNA. K vlastní regulaci exprese CD47 tak může docházet jak na transkripční, tak na translační úrovni. Pro správné fungování CD47 je však důležitá také jeho správná lokalizace v buňce spolu s agregační topologií proteinů. Důkladné porozumění...
|
|
|
3D zobrazovací metody myšího mozku se zaměřením na projasnění tkáně
Novák, Jaromír ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Němec, Pavel (oponent)
1 ABSTRAKT Mikroskopické techniky jsou stěžejními metodami pro zkoumání tkání jak ve výzkumu, tak v klinické praxi. Vzhledem k tomu, že většina tkání je v silnějších vrstvách neprůhledné, je nesnadné přímo zkoumat jejich trojrozměrnou strukturu světelnou mikroskopií. Ta je však vnitřně spjatá s biologickými funkcemi buněk a jimi tvořených tkání a orgánů. Nejčastějším způsobem zkoumání je rozřezání vzorků na tenké plátky, jejich nasnímání a následná digitální rekonstrukce trojrozměrné struktury. Jinou možností je projasnění celých vzorků pomocí postupného ošetření sérií činidel. Tím je umožněno zobrazovat je vcelku, bez potřeby jejich fyzického řezání. Přesto, že tato technika byla využita už před více než stoletím, její výraznější rozvoj nastal až v posledních několika letech. Došlo tak k objevu množství vhodných látek a několika nových principů jimiž lze projasnění vzorku dosáhnout. Metodiky se rozvíjí směrem k projasňování čím dál větších objemů, automatizaci celého procesu, lepšímu zachování co nejpřirozenějšího stavu tkáně a k co největší kompatibilitě s různými druhy značení, zvláště pak s barvením pomocí protilátek a fluorescenčních barviv. Rozvoj projasňovacích metodik jde ruku v ruce s novými technikami na poli fluorescenční mikroskopie, jako je například SPIM ("single plane illumination...
|
|
|
Povrchový fenotyp nádorových kmenových buněk (CSC) lidských karcinomů
Bočková, Marie ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Čermák, Vladimír (oponent)
Nádor se sestává z heterogenní masy buněk, které lze - podobně jako zdravé orgány a tkáně lidského těla - rozdělit dle morfologických, funkčních či expresních hledisek na jednotlivé buněčné populace. Populaci buněk, která dává vznik všem těmto buněčným liniím, označujeme jako nádorové kmenové buňky (CSC). Tyto CSC nejen že mají vlastnosti běžných kmenových buněk, tj. schopnost sebeobnovy a dát vzniku heterogenní populaci diferencujících se buněk, ale jsou zpravidla také nejodolnější subpopulací v nádoru, která je vysoce odolná vůči léčbě a způsobuje reziduální nemoc. Znalost CSC biomarkerů jednotlivých typů nádorů významně zvýší účinnost léčby, která může být skrze tyto biomarkery lépe zacílena. Hledání unikátního genového otisku pro CSC jednotlivých nádorových onemocnění je umožněno díky tak zvaným -omickým přístupům, zvláště charakteristice povrchového proteomu buněk, jehož prostřednictvím buňka komunikuje s okolím. Dnes je známo, že CSC karcinomu močového měchýře exprimují ve vysokých množstvích CD44, CD90 a CD49f, které jsou používané k identifikaci těchto buněk, mezi ostatními znaky ještě jmenujme molekulu CD47 s imunosupresivní funkcí.
|
|
|
Antigenome defines a selection of mutated tumor peptides driving tumor-specific T-cell response
Hadlová, Petra ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Dibus, Michal (oponent)
T buňky, nezastupitelná součást adaptivního imunitního systému, hrají důležitou roli při eradikaci růstu nádoru. T buňky antigenně-specificky cílí, zajišťují interakci a následně i likvidují nádorové buňky. Interakci T buněk s nádorovými buňkami zprostředkovávají krátké, nádorově specifické epitopy. Epitopy jsou T buňkám prezentovány na povrchu nádorových buněk navázané na molekuly hlavního histokompatibilního komplexu (MHC). Nádorově specifické epitopy vznikají v důsledku náhodných somatických mutací a jsou součástí nádorového antigenomu. Antigenom se skládá ze dvou skupin antigenů, nádorově specificických (TSA) a asociovaných s nádory (TAA). TSA jsou unikátní pro každý nádor zatímco TAA jsou prezentovány nádorovými i vlastními buňkami pacienta. Nádorové buňky vyvinuly několik způsobů jak imunitní reakci na úrovni T buněk, NK buněk, makrofágů i dalších mechanismů uniknout. Navzdory tomu, má imunoterapie v personalizované medicíně obrovský potenciál. Stratifikace reagujících pacientů je pro nasazení vhodné léčbu zcela zásadní. Využití spektra metod umožnilo studium mutací u jednotlivých pacientů, role mutací ve vývoji nádoru, existujících reaktivních T buněčných klonů a přítomných specifických epitopů. Tyto poznatky pomáhají navrhnout nejefektivnější stratifikace a eventuálně i léčbu zacílenou na...
|
|
|
Savčí imunitní odpověď proti progenitorovým typům buněk včetně indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSCs)
Kovandová, Barbora ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Pozornost vědců se již dlouho obrací ke kmenovým buňkám jakožto k velmi užitečnému nástroji pro regenerativní medicínu. Kmenové buňky jsou teoreticky schopné nahradit či znovu vytvořit jakoukoliv tkáň a mohly by tak opravovat nebo nahradit tkáně poškozené ať už stářím, tak nemocí či úrazem. Nejprve je však nutné se vypořádat s problémy, které jejich užití provází. Mezi tyto problémy patří hlavně jejich imunogenicita, tedy schopnost vyvolat imunitní odpověď příjemce. Tato bakalářská práce popisuje právě imunogenicitu embryonálních (ESC), indukovanými pluripotentních (iPSC) i dospělých tělních kmenových buněk (ASC). Tkáně vzniklé z ESC byly in vivo popsány jako silně imunogenní, byť byly na základě původních in vitro pokusů popsány jako imunosupresivní. Také mají potenciál tvořit nádory, což je další nebezpečí jejich užití. Nemluvě o etických problémech, které jejich používání provází. iPSC se zdají jako dobrým, eticky i imunologicky nezávadným řešením situace. Z hlediska imunogenicity tomu tak však není, bylo popsáno, že jsou imunogenní i v autologním prostředí. Hlavní problém, který v současnosti brání jejich běžnému využití, je jejich schopnost tvořit nádory. Imunogenicita i tumorigenicita může být následek metody, kterou jsou dediferencovány zpět na kmenový stav. Užití ASC opět není spojeno s...
|
|
|
Metodiky detekce antigen-specifických T buněk ex vivo
Kolařík, Daniel ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Antigen-specifické T buňky jsou zásadní složkou adaptivní imunity. Podílejí se na ochraně organismu před extracelulárními i intracelulárními patogeny i před vznikem nádorového bujení. Porucha jejich funkce může vést ke vzniku autoimunitních poruch nebo alergií. Proto je jejich detekce a případná další manipulace zásadní pro klinickou imunologii. V této práci jsou rozebrány dvě významné metody, které v současné době slouží ke studiu antigen-specifických T buněk. Jedná se o zjištění okamžitého stavu průtokovou cytometrii a o časovou detekci jednotlivých buněk v mikrojamkách. Informace získané těmito kompatibilními metodami mají potenciál pro medicínské využití jak v oblasti prevence, tak v oblastech diagnostiky a terapie relevantních lidských patologií.
|
|
|
Povrchová exprese CD47 na nádorových kmenových buňkách jako cíl protinádorové léčby
Kuzmík, Ján ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
CD47 je transmembránový glykoproteín s vysokou mierou expresie na zdravých a nádorových (kmeňových) bunkách. Miera expresie CD47 je záporne korelovaná s prežitím pacientov s nádorovým ochorením. Väzba CD47 so SIRPα, lokalizovanom na fagocyte, spúšťa vnútrobunkovú signalizačnú kaskádu. Konečným účinkom tejto kaskády je defosforylácia nesvalového myozínu IIA, ktorá narúša jeho funkciu a akumuláciu do miesta fagocytickej synapsie. Blokovanie CD47-SIRPα signalizačnej osi za prítomnosti pro-fagocytického signálu indukuje fagocytózu nádorových buniek. Fagocyty následne môžu plniť úlohu antigén prezentujúcich buniek a spustiť protinádorovú T bunkovú odpoveď. Funkcia CD47-SIRPα signalizačnej osi v imunite robí z tejto osi cieľ testovania protinádorovej liečby. Preklinický výskum identifikoval terapeutickú účinnosť blokovania tejto signalizačnej osi. V súčasnosti prebieha prvá fáza klinického testovania. Najčastejším terapeutickým spôsobom blokovania signalizačnej osi CD47-SIRPα je použitie anti-CD47 blokujúcich monoklonálnych protilátok. Použitím týchto protilátok dochádza k miernej anémii. Avšak vyvíjané sú aj alternatívne spôsoby blokovania tejto signalizačnej osi. V tejto bakalárskej práci zhŕňam výskum spojený s blokovaním CD47-SIRPα signalizačnej osi ako protinádorovej liečby.
|
|
|
Změny střevního mikrobiomu u pacietů s idiotypickými střevními záněty léčenými pomocí anti-TNF-α
Damašková, Dagmar ; Mrázek, Jakub (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
česky Crohnova choroba spadá společně s ulcerózní kolitidou do skupiny idiopatických střevních zánětů označovaných jako IBD (inflammatory bowel disease). Vyskytuje se především ve vyspělých zemích, kde pacientů s touto nemocí neustále přibývá. IBD je imunologicky podmíněné multifaktoriální onemocnění, jehož mechanismus vzniku stále není znám. Zavedeným léčebným postupem je léčba zánětu pomocí kortikosteriodů a imunosupresiv. Kromě střevního zánětu, který je primárním cílem léčby, je u pacientů prokázaná i střevní dysbióza. Právě mikrobiota může být jedním z možných terapeutických cílů a léčebným postupem adjuvantní nebo biologická terapie. Adjuvantní terapie přímo cílí střevní mikrobiotu za pomoci probiotik, kdežto cílem biologické léčby je TNF-α, prozánětlivý cytokin, produkovaný ve velké míře makrofágy. Cílem této diplomové práce je zhodnotit změny střevní mikrobioty u IBD pacientů ve vztahu k adjuvantní a biologickou terapii. Pro analýzu bakteriální diverzity byly vyzkoušeny tři možné metody izolace DNA. Rapid beat beating + column (RBB+C) byla vybraná pro analýzu vzorků pacientů, protože vykazovala jak největší výtěžek DNA, tak nejvyšší čistotu DNA. Nejprve byla diverzita zkoumána kvalitativně pomocí degradační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) s následnou sekvenací zajímavých bandů. Dále...
|
host ::
