|
|
Stimulace proliferace β-buněk pankreatu pomocí syntetické mRNA
Volejníková, Anna ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je závažné metabolické onemocnění spojené s téměř úplnou ztrátou insulin-produkujících β-buněk nebo s výrazným snížením jejich funkčnosti. Předmětem současného výzkumu je proto hledání efektivních způsobů regenerace β-buněk. Jedním z možných způsobů je stimulace jejich proliferace. Jako potenciálně vhodná molekula pro stimulaci proliferace pankreatických β-buněk se jeví transkripční faktor c-Myc. Navýšení exprese tohoto onkoproteinu formou adenovirových nosičů s sebou ovšem nese riziko dediferenciace buněk a rozvoje nádorového bujení. Z tohoto důvodu byla v předkládané diplomové práci ověřena možnost využití synteticky připravené mRNA pro expresi proteinu c-Myc. Použití in vitro připravené c-Myc- mRNA umožňuje v cílové buňce dosáhnout krátkodobé, avšak vysoké míry exprese transkripčního faktoru c-Myc. Po transfekci syntetické c-Myc-mRNA do buněk disociovaných potkaních Langerhansových ostrůvků byla v buňkách pomocí metody nepřímé imunofluorescence detekována exprese c-Myc na proteinové úrovni ve vysoké míře. Po 48 hodinách od transfekce buněk nebyla již exprese c-Myc v tak vysoké míře detekována. Právě fyziologická degradace c-Myc-mRNA cílovou buňkou je faktor, který výrazně snižuje riziko rozvoje nádorového bujení. Transfekce c-Myc-mRNA do potkaních ostrůvkových buněk způsobila...
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium transportu chloridových iontů u buněk plicního epitelu pacientů trpících cystickou fibrosou
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
U onemocnění zvaného cystická fibróza dochází k narušení fungování proteinu CFTR, jehož hlavní funkcí je transport chloridových iontů z buňky. Stanovení schopnosti CFTR kanálu transportovat chloridové ionty je považováno za jediný způsob, jak stanovit jeho aktivitu. V této práci byl transport chloridových iontů prostřednictvím CFTR kanálu studován u buněčných linií plicního epitelu zdravých pacientů (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou (CuFi-1). Pro studium byla vybrána a optimalizována metoda fluorescenčního značení za použití fluorescenčního barviva N- (ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), které poskytuje fluorescenci v modré oblasti spektra a je nejcitlivější fluorescenční sloučeninou vůči chloridovým iontům, která byla doposud navržena. V rámci vývoje optimální metody byly pomocí fluorescenčního značení testovány dva způsoby měření transportu chloridových iontů a to stanovení jejich množství uvolněných buňkou do pufru obsahujícího MQAE a stanovení jejich množství v buňce přímo obarvené MQAE. Druhé stanovení se ukázalo jako vhodnější a reprodukovatelnější metoda pro prokázání transportu chloridových iontů. Zároveň byl sledován vliv sloučeniny forskolinu, která zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a tím urychluje otevírání CFTR kanálu, díky čemuž může být ověřeno, zda...
|
|
| |
|
| |
|
|
Možné přístupy k terapii cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je genetické onemocnění způsobené mutací v CFTR genu. To má za následek absenci či špatnou funkčnost CFTR chloridového kanálu, který je i zásadním regulátorem dalších iontových kanálů. Tato práce se zaměřila na studium genové terapie cystické fibrózy pomocí genového přenosu CFTR-mRNA. K určení exprese CFTR proteinu bylo použito metod nepřímé imunofluorescence a Western blot imunodetekce. Zároveň byla stanovena relativní míra genové exprese CFTR genu pomocí kvantitativní PCR. K experimentům byly použity buněčné linie zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu s homozygotní mutací F508del (CuFi-1) a zárodečného ledvinného epitelu (HEK293S). CFTR protein byl vizualizován uvedenými metodami pomocí šesti primárních protilátek (432, 450, 570, 596, 769, CF3). Pro detekci CFTR proteinu pomocí metody nepřímé imunofluorescence byly jako nejvhodnější vybrány primární protilátky 570 a CF3. V případě metody Western blot byla pro detekci uvedeného proteinu vhodná pouze protilátka CF3. Stanovením relativní míry genové exprese CFTR genu bylo zjištěno, že tento gen je exprimován u studovaných buněčných linií v malém množství, přičemž míra jeho exprese je v buněčné linii CuFi-1 přibližně šestkrát vyšší než v buněčné linii NuLi-1. Byla zkoumána též účinnost transfekce buněčné linie CuFi-1...
|
|
|
Účinky přírodních látek na viabilitu nádorových buněčných linií
Boleslavská, Barbora ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Nádorová onemocnění jsou jedním z nejzávažnějších problémů současné medicíny a jejich incidence neustále stoupá. Navzdory výraznému rozvoji terapeutických metod v posledních letech jsou tato onemocnění stále velmi obtížně léčitelná. Předkládaná práce se zabývá sledováním účinků přírodních látek - epigalokatechin galátu, kofeinu, etanolového extraktu z Cannabis sativa, vodného extraktu z Origanum acutidens a vodného extraktu z Mentha piperita na lidskou neuroblastomovou buněčnou linii UKF-NB-4. První část práce se zabývá určením viability lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Dále je studován vliv těchto látek na buněčný cyklus, aktivitu kaspáz a schopnost vyvolat apoptosu. Detekce výše zmíněných charakteristik byla prováděna na buněčném analyzátoru MUSETM a na průtokovém cytometru. Následně byla pomocí metody Western blot sledována hladina proteinu p53 a retinoblastomového proteinu v buněčné linii UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Největší vliv měl na viabilitu a buněčný cyklus lidské neuroblastomové buněčné linie epigalokatechin galát. Jeho působením dochází ke snížení viability UKF-NB-4, ke snížení exprese retinoblastomového proteinu a k zadržení přechodu buněk z G0/G1 do S fáze buněčného cyklu. Z výsledků nevyplývá, že by epigalokatechin...
|
|
|
Vliv optimalizace genu na rekombinantní expresi lidského cytochromu P450 3A4
Svobodová, Barbora ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Cytochrom P450 3A4 je integrální protein vyskytující se v membráně endoplasmatického retikula. U člověka se v nejvyšší míře vyskytuje v jaterní tkáni. Je důležitým enzymem metabolismu xenobiotik. V procesech biotransformace přeměňuje zhruba polovinu všech používaných léčiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo ověřit vliv genové optimalizace na heterologní expresi lidského cytochromu P450 3A4. Při řešení práce byly nejprve připraveny a ověřeny expresní konstrukty založené na vektoru pET22b. Byla porovnána efektivita exprese zkrácené formy zájmového proteinu za použití syntetického genu optimalizovaného pro produkci v hostitelském organismu odvozeném od parentálního kmene K-12 vůči produkci stejně zkráceného cytochromu P450 3A4 v témže vektoru ovšem s originálním lidským genem získaným z cDNA. Bylo potvrzeno, že optimalizace nukleotidové sekvence genu pro hostitelský organismus E. coli skutečně činnost exprese zkrácené formy proteinu zvyšuje, i když množství aktivní formy proteinu nedosahuje výtěžků obvyklých u jiných netoxických solubilních proteinů. Kromě toho byl učiněn pokus o produkci kompletní nezkrácené formy lidského cytochromu P450 3A4 v expresním vektoru pET22b. Množství této formy proteinu přítomné v bakteriální membránové frakci však bylo ve srovnání se zkrácenou formou mnohem nižší....
|
|
|
Charakterizace pankreatických beta-buněk po jejich stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené ztrátou beta-buněk slinivky břišní, ke které dochází v důsledku autoimunitní destrukce, či zvýšené apoptózy beta-buněk. Nedostatek beta-buněk má za následek sníženou produkci insulinu, který hraje významnou roli v metabolismu glukosy. Počet beta-buněk organismu je jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje vznik tohoto chronického onemocnění. Z tohoto důvodu bylo vhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné počet beta-buněk organismu navýšit a obnovit tak přirozenou cestou produkci insulinu bez jakékoliv nutnosti využívání insulinových infuzí. Schopnost buněčného dělení beta-buněk ovšem s věkem klesá a v dospělosti je prakticky nulová. Nadějnou cestou k obnově insulin produkující tkáně se tak jeví studium buněčného cyklu beta-buněk, především poté časných a pozdních cyklinů a cyklin dependentních kinas, které působí jako regulátory buněčného cyklu. S cílem zvýšit počet beta-buněk vstupujících do buněčného cyklu jsme se zaměřili na studium vlivu in vitro připravených (IVT) mRNA cyklinů typu D a cyklin dependentních kinas 4 a 6 na stimulaci buněčného dělení izolovaných beta-buněk. Zjistili jsme, že transfekce IVT mRNA pro cykliny typu D v kombinaci s cyklin dependentními kinasami 4 a 6 výrazně zvyšuje proliferaci beta-buněk uvězněných v klidové fázi...
|
|
|
Moderní terapie cystické fibrózy
Křesťan, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cystická fibróza je autozomálně recesivní onemocnění, které je způsobeno mutacemi v CFTR genu. Cílem práce je shrnutí zjištěných skutečností z oblasti léčby cystické fibrózy CFTR modulátory. V první části práce je popsáno samotné onemocnění, jeho historie a příznaky. Rovněž jsou zde uvedeny příčiny onemocnění, a to formou popisu CFTR genu a mutací, které vedou k onemocnění cystickou fibrózou. V práci je rovněž popsána funkce CFTR proteinu. Dále se práce věnuje symptomatické léčbě a zmiňuje genovou terapii. Druhá část práce shrnuje aktuální poznatky o léčbě CFTR modulátory. Rozděluje tyto sloučeniny dopěti skupin na CFTR potenciátory, korektory, amplifikátory, stabilizátory a read- through agents. V poslední části práce je nastíněn pohled do budoucna vzhledem k modulátorovým terapiím, které jsou ještě ve vývoji.
|
|
|
Stimulace proliferace β-buněk pankreatu pomocí syntetické mRNA
Volejníková, Anna ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je závažné metabolické onemocnění spojené s téměř úplnou ztrátou insulin-produkujících β-buněk nebo s výrazným snížením jejich funkčnosti. Předmětem současného výzkumu je proto hledání efektivních způsobů regenerace β-buněk. Jedním z možných způsobů je stimulace jejich proliferace. Jako potenciálně vhodná molekula pro stimulaci proliferace pankreatických β-buněk se jeví transkripční faktor c-Myc. Navýšení exprese tohoto onkoproteinu formou adenovirových nosičů s sebou ovšem nese riziko dediferenciace buněk a rozvoje nádorového bujení. Z tohoto důvodu byla v předkládané diplomové práci ověřena možnost využití synteticky připravené mRNA pro expresi proteinu c-Myc. Použití in vitro připravené c-Myc- mRNA umožňuje v cílové buňce dosáhnout krátkodobé, avšak vysoké míry exprese transkripčního faktoru c-Myc. Po transfekci syntetické c-Myc-mRNA do buněk disociovaných potkaních Langerhansových ostrůvků byla v buňkách pomocí metody nepřímé imunofluorescence detekována exprese c-Myc na proteinové úrovni ve vysoké míře. Po 48 hodinách od transfekce buněk nebyla již exprese c-Myc v tak vysoké míře detekována. Právě fyziologická degradace c-Myc-mRNA cílovou buňkou je faktor, který výrazně snižuje riziko rozvoje nádorového bujení. Transfekce c-Myc-mRNA do potkaních ostrůvkových buněk způsobila...
|
host ::
RSS.