|
|
Study of exosomes in polyomavirus infection
Hyka, Lukáš ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Exosomy jsou extracelulární váčky endosomálního původu. Původně se myslelo, že exosomy slouží pouze k vylučování buněčného odpadu, avšak se ukázalo, že slouží i ke komunikaci mezi buňkami a hrají roli i ve virových infekcích. Exosomy jsou využívány viry např. k přenosu virového proteinu či jejich RNA/DNA. Jedním z virů, u kterého není role exosomů při infekci objasněna je myší polyomavirus. Myší polyomavirus patří do čeledi Polyomaviridae, do které spadá i řada lidských virů, jako je např. JC virus či virus Merkelova karcinomu. Myší polyomavirus kóduje malý, velký a střední T antigen a tři kapsidové proteiny. O středním T antigenu je známo, že se váže na buněčné membrány. Vzhledem k tomu, že exosomy jsou membránově odvozené struktury, zaměřili jsme se možný přenos středního T antigenu. K tomuto cíli bylo potřeba nejdříve zvládnout metody izolace exosomů a jejich charakterizace. Exosomy byly izolovány pomocí ultracentrifugace a dále purifikovány na hustotním gradientu OptiPrep. Charakterizovány byly pomocí elektronové mikroskopie, přístroje NanoSight a proteinových exosomových markerů. Mezi tyto markery patří například Alix, či flotillin-1. Dále byly buňky transfekovány, aby exprimovali střední T antigen. Bylo ukázáno, že exosomy izolované z těchto buněk skutečně obsahovali střední T antigen....
|
|
|
Role BK polyomaviru v lidských nádorech
Cirbusová, Adéla ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
BK polyomavirus (BKV) je malý neobalený ubikvitně rozšířený DNA virus, který u imunosuprimovaných jedinců může způsobovat závažná onemocnění, konkrétně BK polyomavirovou nefropatii (BKVaN) a hemoragickou cystitidu. Mimo toho se o BKV uvažuje jako o možném původci některých nádorových onemocnění u člověka. Je zde několik skutečností, které by tomuto spojení nasvědčovaly. BKV ve svém genomu kóduje tři onkoproteiny, díky kterým u hlodavců indukuje vznik celé řady nádorů. Onkogenní potenciál byl prokázán i na buněčných kulturách. Současně byl BKV genetický materiál detekován v lidských nádorových tkání. Tato fakta tedy podporují myšlenku, že by BKV mohl být onkogenní i u člověka. Jako pravděpodobná se prozatím zdá možná účast BKV v karcinomu močového měchýře u pacientů po transplantaci ledvin a je uvažována možnost, že je BKV jedním z faktorů, které mohou zapříčinit vznik adenokarcinomu prostaty. Avšak doposud nebyl předložen stoprocentní důkaz, který by tyto souvislosti potvrdil a je tedy nutná řada dalších studií, které by mohly přinést nové poznatky a roli BKV jako možného původce některého z těchto nádorových onemocnění potvrdit či naopak vyvrátit. klíčová slova: BKV, rakovina, LTag, prostata, močový měchýř
|
|
|
Vakcíny proti viru dengue
Holšteinová, Aneta ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Poláková, Ingrid (oponent)
Od poloviny 20. století dochází k neustálému zvyšování počtu jedinců infikovaných virem dengue (DENV). Specifická antivirotika nejsou k dispozici, a tak se hlavním cílem při eliminaci transmise stala konstrukce účinné a bezpečné vakcíny. Důraz je kladen na vyvolání vyvážené imunitní odpovědi proti všem sérotypům DENV. Momentálně je jedinou licencovanou vakcínou CYD-TDV (Chimeric Yellow Fever-Dengue, Live-Attenuated, Tetravalent Dengue Vaccine). Ta využívá kostru účinné a bezpečné vakcíny proti viru žluté zimnice (YFV), ze které jsou odebrány sekvence pro povrchové proteiny a nahrazeny odpovídajícími sekvencemi DENV. Zatímco preklinické studie vykazovaly slibné výsledky, při klinických studiích se začaly objevovat komplikace a z nich vycházející omezující kritéria pro její využití. Proto se pokračuje ve vývoji dalších vakcín, které by mohly zajistit lepší ochranu proti DENV širšímu spektru populace a nahradit tak CYD-TDV. Ve III. fázi klinických studií se nachází dvě živé atenuované vakcíny (TetraVax-DV a DENVax). Do I. fáze postoupila podjednotková vakcína (V180), DNA vakcína (TVDV) nebo vakcína obsahující inaktivovaný virus (TDENV PIV). Využívaná je i kombinace více vakcinačních schémat (tetravalentní živá atenuovaná vakcína-tetravalentní purifikovaná inaktivovaná vakcína, TLAV-TPIV). V...
|
|
|
Viruses in the pathogenesis of coeliac disease
Chudá, Kateřina ; Cinek, Ondřej (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Celiakie je chronické zánětlivé onemocnění tenkého střeva. Pro manifestaci nemoci je nezbytná konzumace lepku, která vede k poškozování střevní sliznice v důsledku imunitní reakce namířené vůči složkám lepku. Propuknutí nemoci ovlivňuje řada faktorů majících příčiny v genetických predispozicích daných osob, ale také v prostředí, jakému jsou tito jedinci vystaveni. Z environmentálních faktorů může k rozvoji nemoci přispět například změna jídelníčku nebo prodělaná infekce. Tato práce se zabývá především virovými infekcemi ve vztahu k celiakii - jejich možnou rolí v rozvoji tohoto onemocnění, způsobem interakce s hostitelem nebo jejich významem v populaci. Jako možné kandidátní viry jsou představeny některé herpesviry, reoviry, adenovirus, astrovirus, respirační syncytiální virus a viry hepatitidy B a C. Práce také shrnuje nejvýznamnější současné kohortové studie, jejichž smyslem je, mimo jiné, přispět k objasnění rolí různých vlivů prostředí podílejících se na rozvoji diabetu 1. typu a celiakie, dvou nemocí se společnými genetickými prediktory. Klíčová slova: celiakie, orthoreovirus, rotavirus, adenovirus, astrovirus, respiratory syncytial virus, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, prospektivní kohortová studie
|
|
|
Experimentální a klinicky využitelné vakcíny na bázi viru vakcínie
Pilná, Hana ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Virus vakcinie (VACV) je obalený DNA virus patřící do rodu Orthopoxviridae. Jedná se o laboratorní virus, který nemá v přírodě známého přirozeného hostitele, a jehož přesný původ zůstává doposud neobjasněn. Jeho význam pro člověka je ovšem značný. V prvé řadě to byly právě různé kmeny VACV, které byly použity pro přípravu vakcín při eradikaci pravých neštovic. I dnes je vynakládáno nemalé úsilí na přípravu efektivnějších a bezpečnějších vakcín proti pravým neštovicím, a to mimo jiné kvůli stále existujícím obavám, že by variola virus - původce pravých neštovic - mohl být zneužit jako biologická zbraň. Pokrok v genovém inženýrství umožnil další využití potenciálu VACV jako vektoru, neboť VACV umožňuje inkorporaci cizorodé genetické informace a její expresi v hostiteli. Navíc se VACV replikuje výlučně v cytoplasmě, což snižuje riziko začlenění virové DNA do DNA hostitele. Tyto a další vlastnosti dělají z VACV ideálního kandidáta na vektor pro přípravu vakcín proti celé řadě heterologních infekčních a onkologických onemocnění. Tato práce podává přehled klinicky využívaných a některých experimentálních vakcín odvozených z VACV. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Charakterizace imunitní odpovědi proti lidskému polyomaviru MCPyV.
Vochozková, Petra ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Drda Morávková, Alena (oponent)
Charakterizace imunitní odpovědi proti lidskému polyomaviru MCPyV Počet lidských polyomavirů se v posledních letech značně rozrostl, nyní jich známe 12. Je pravděpodobné, že většina lidských polyomavirů navozuje celoživotní persistentní infekci. Primární infekce je obvykle bezpříznaková a vyvolá tvorbu protilátek proti virové kapsidě. Komplikace způsobené polyomaviry se objevují u lidí s oslabeným imunitním systémem. Polyomavirus karcinomu Merkelových buně (MCPyV) je spojován se vznikem kožního nádoru - karcinomu z Merkelových buněk (MCC). I když je tento kožní nádor poměrně vzácný, infekce MCPyV je velmi běžná. Většina lidské populace má vytvořeny MCPyV specifické protilátky. Ty jsou přítomné i u pacientů s MCC a na mnohem vyšší hladině než u zdravých jedinců. MCC se vyskytuje častěji u lidí s oslabeným imunitním systémem. Zdá se, že ochrana protilátkami před vznikem nádoru není dostatečná a vývoj nádoru by mohl být spíše pod dohledem buněčné imunity. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci hlavního kapsidového proteinu VP1 MCPyV a studium protilátkové odpovědi proti tomuto polyomaviru. Myši imunizované DNA vakcínou produkující protein VP1 vytvořili protilátky proti tomuto proteinu. Z hmyzích buněk infikovaných rekombinantním bakulovirem kódujícím protein VP1 byly získány složené prázdné...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Vývoj experimentálního systému založeného na Cre/LoxP rekombinaci pro produkci polyomavirových mutant.
Hron, Tomáš ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Myší polyomavirus je významným zástupcem čeledi Polyomaviridae s potenciálním využitím v genové terapii a imunoterapii. Práce s virovými mutantami je důležitou součástí jeho studia, ale současné metody jejich produkce jsou pracné a poskytují nízký výtěžek. Tato práce se zabývá vývojem nového experimentálního sytému, který umožňuje pomocí Cre/loxP rekombinace generovat intaktní polyomavirový genom z rekombinantního plazmidu in vivo. Během rekombinace dochází k nevyhnutelnému vložení jednoho loxP místa do vzniknuvšího virového genomu. Byly připraveny dvě varianty produkčních plazmidů, které vytvářejí virový genom divokého typu s loxP místem vloženým mezi poly(A) signální sekvence časných a pozdních genů, nebo v intronové oblasti časných genů. Inzerce loxP místa mezi poly(A) signální sekvence měla dramatický dopad na expresi virových genů a vedla k úplné ztrátě infektivity viru. Naopak, substituce loxP místa v intronové oblasti časných genů produkci infekčního viru umožnila. Pro zajištění exprese Cre rekombinázy jsem také vytvořil stabilně transfekované buněčné linie, které mohou přípravu viru zjednodušit. Tato práce ukazuje, že nově navržený systém poskytuje uspokojivý výtěžek viru, řeší omezení vyskytující se u běžně používaných metod a může být využit pro produkci málo infekčních virových mutant. Powered by...
|
|
|
Lidský polyomavirus izolovaný z karcinomu Merkelových buněk
Vochozková, Petra ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Lidské polyomaviry patří do rodiny Polyomaviridae. Do dnešní doby bylo objeveno pět lidských polyomavirů (BK, JC, KI, WU a MCV). První část práce se zabývá průběhem infekce polyomaviry. Tyto malé neobalené viry vnikají do hostitelské buňky receptorem zprostředkovanou endocytózou. Cestou přes ER se dostávají do jádra, kde se virus množí a exprimuje proteiny. Infekce se objevuje už v raném dětství a u zdravých jedinců zůstává virus skryt bez příznaků. Ovšem při oslabení imunitního systému je virus schopen reaktivace a u některých polyomavirů může být příčinou některých onemocnění. Druhá část práce je zaměřena přímo na MCV. Genom MCV byl před dvěma lety nalezen v karcinomu Merkelových buněk (MCC). MCV infikuje Merkelovy buňky a jeho DNA se integruje do genomu hostitelské buňky. MCV lze v části nádorů detekuje použitím metody PCR. Stejnou metodou se také v MCC našly virové sekvence kódující část velkého a malého T antigenu, ze kterých se v buňkách nádoru exprimuje významné množství onkoproteinů. V souvislosti s výskytem BK či JC virů v nádorech tyto faktory naznačují významnou roli MCV při vzniku nádoru. Studium může pomoci k objevení nových přístupů pro léčbu MCC a jiných biologicky podobných nádorů.
|
|
| |
host ::
RSS.