|
Využití metody RNA interference pro cílenou inhibici exprese genů na úrovni mRNA
Radilová, Hana ; Kvasničková, Eva (vedoucí práce) ; Šmarda, Jan (oponent) ; Flachs, Pavel (oponent)
Cyklooxygenáza (COX) je klíčovým enzymem v metabolismu arachidonové kyseliny (AA). Přeměňuje AA na prostaglandin H2, který je dále metabolizován různými enzymy na biologicky aktivní prostanoidy. Tato práce byla zaměřena na studium vztahů mezi geny souvisejícími s metabolismem AA. Pomocí RNA interference byla specificky snižována exprese vždy jedné z izoforem COX v buněčné linii rakoviny děložního čípku (Hep2). Cyklooxygenáza 1 (COX-1) byla úspěšně inhibována jak pomocí siRNA ("small interfering RNA"), tak shRNA ("short hairpin RNA") sekvencí. Pro snížení exprese cyklooxygenázy 2 (COX-2) se nepodařilo získat výrazně účinnou sekvenci shRNA. Bylo připraveno několik klonů buněčné linie Hep2 se specificky a stabilně inhibovanou expresí COX-1 (Hep2_shRNA1), které byly využity pro další studie. Snížení COX-1 bylo potvrzeno na úrovni mRNA pomocí real-time PCR, na úrovni proteinů pomocí Westernu blotu a na funkční úrovni metodou ELISA. Specifická a stabilní inhibice exprese COX-1 způsobila výrazné snížení mikrozomální prostaglandin E syntázy 1 (mPGES-1). Dále bylo v linii Hep2_shRNA1 nalezeno významné zvýšení hladiny mRNA genu ABCC4 ("ATP-binding cassette, sub-family C, member 4"). Tento gen kóduje transportér MRP4 ("Multidrug resistance protein 4"), který je přenašečem některých cytostatik, antivirotik a...
|
|
Interactive Influence of Genetic Effects and Effects of External Environment on Properties of Large Arteries in Relation to Sodium Management
Seidlerová, Jitka ; Filipovský, Jan (vedoucí práce) ; Widimský, Jiří (oponent) ; Segers, Patrick (oponent) ; Herijgers, Paul (oponent)
V souladu s Guytonovou prací bylo cílem našeho výzkumu prozkoumat ve třech evropských populacích, zda jsou vlastnosti velkých tepen spojeny s ledvinným sodným hospodařením, jež samotné je ovlivněno zevními a genetickými vlivy. Před započetím genetických analýz jsme studovali rodinnou agregaci a děditelnost tepenných vlastností. Ve všech našich analýzách jsme zohlednili vliv příbuznosti mezi účastníky, stejně jako vliv významných proměnných. V první práci jsem porovnávali vlastnosti tepen a krevní tlak (TK) mezi normotenzními potomky dvou normotenzních rodičů (OFF/NT) a normotenzními potomky, kteří měli alespoň jednoho hypertenzního rodiče (OFF/HT). Pulzní tlak (PPp) jsem měřili jak konvenčně, tak pomocí 24-h monitorace TK. Centrální (CAIx) a periferní (PAIx) augmentační index, centrální pulzní tlak (PPc) a rychlost pulzové vlny (aPWV) jsme měřili přístrojem SphygmoCor. V porovnání s OFF/NT (n=59; věk 16 až 34 let), měli OFF/HT (n=174; 17 až 40 let) vyšší (0,14<P<0,0007) konvenční TK, měřený jak konvenčně (121/75 vs. 114/71 mm Hg a 46 vs. 42 mm Hg) tak 24-h monitorací TK (118/70 vs. 114/67 mm Hg a 48 vs. 47 mm Hg). OFF/HT v porovnání s OFF/NT, měli také vyšší (0,05<P<0,0008) PPc (28 vs. 26 mm Hg), PAIx (54,7% vs. 44,9%), CAIx (108,8% vs. 99,8%), a aPWV (7,4 vs. 6,6 m/sec). Nicméně pro CAIx, PAIx a aPWV...
|
|
Structure and evolution of efflux pump in gramnegative bacteria.
Gálová, Diana ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Matyska Lišková, Petra (oponent)
Rezistencia mikroorganizmov na antibiotiká je významným problémom a neustále pribúda prípadov patogénnych baktérií rezistentných na bežne užívané antibiotiká. K jedným z hlavných mechanizmov rezistencie u gramnegatívnych baktérií patrí aktívny eflux, schopný udržovať intracelulárnu koncentráciu noxy pod toxickou úrovňou. Efluxné pumpy radíme do piatich rodín transportérov, fungujúcich prevažne na princípe transportu drogy voči protónu, v menšom zastúpení na hydrolýze ATP. U patogénov sú hlavnou príčinou rezistencie pumpy so širokou substrátovou špecifitou, tzv. MDR (multidrug resistance) pumpy, zastúpené hlavne RND nadrodinou. Pôvodcom efluxných púmp sú pravdepodobne producenti antibiotík a organizmy vystavené vo svojom prirodzenom prostredí toxickým látkam. K šíreniu do iných baktérií potom dochádza horizontálnym génovým transférom. Usudzuje sa, že efluxné pumpy sa vyvinuli z transportérov pôvodne zaobstarávajúcich fyziologické funkcie ako transport endogénnych substrátov.
|
|
Is Ceanorhabditis Elegans a Suitable Model Organism for the Study of Human Lysosomal Enzymopathies? A Study of Fabry, Schindler, Pompe and Mucopolysaccharidosis IIIC Diseases in C. Elegans and Humans, Respectively
Uřinovská, Jana ; Elleder, Milan (vedoucí práce) ; Smetana, Karel (oponent) ; Raška, Ivan (oponent)
The Ph.D. thesis is focused on lysosomal storage disorders (LSD) with impaired lysosomal metabolism of glycans, namely on Fabry, Schindler, Pompe diseases and muccopolysaccharidosis (MPS) type IIIC. We hypothesized that the worm, which has active glycan metabolism, will have orthologs corresponding to human enzymes deficient in the above disorders and could be a suitable model for study of cellular pathology of these LSDs. The protein families of glycosidases which are deficient in the first three disorders are well characterised while the protein deficient in MPS IIIC was unknown and its enzymatic action was only partially characterized. The gene deficient in MPS IIIC was recently identified in our lab (publication 2) and, as is shown below, it belongs to the lysosomal proteins that have no apparent ortholog in the worm. The main task of the thesis was to find and characterize the C. elegans orthologs of human α-galactosidase (α-GAL), α-N-acetylgalactosaminidase (α-NAGA), acid α- glucosidase (GAA) and heparin acetyl-coenzyme A:α-glucosaminide N-acetyltransferase (HGSNAT) whose deficit leads to Fabry, Schindler, Pompe and MPS IIIC diseases, respectively, and to study their biological functions in C. elegans by RNA-mediated interference (RNAi). Additional aims were to perform basic bioinformatic analysis and...
|
|
Clinical impact of cytochrome c oxidase disorders
Böhm, Marek ; Zeman, Jiří (vedoucí práce) ; Procházková, Dagmar (oponent) ; Doležel, Zdeněk (oponent)
Práce vznikla v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch Kliniky dětského a dorostového lékařství 1. LF UK v Praze, která je diagnostickým centrem pro pacienty s mitochondriálním onemocněním z ČR a SR. Ve spolupráci s The Division of Metabolic Diseases in Department of Paediatrics, The Children's Memorial Health Institute, Warsaw, Poland byla provedena retrospektivní multicentrická studie u 180 dětí s poruchou cytochrom c oxidázy (COX), která byla zaměřena na analýzu klinických projevů onemocnění, molekulární podstatu onemocnění a prognózu. U většiny pacientů mělo onemocnění rychle progredující průběh a prognóza byla většinou krajně nepříznivá. Genetické poradenství v postižených rodinách vyžaduje detailní objasnění molekulární podstaty poruchy COX. U 42 % dětí byly nalezeny mutace v mitochondriální DNA (mtDNA) nebo v nukleárně kódovaných genech pro proteiny surf1 a sco2, které se podílejí na assemblaci COX. Zatímco pacienti s mutacemi v SURF1 a SCO2 genech měli izolovanou poruchu COX, u pacientů s mutacemi v mtDNA byla porucha COX kombinována se snížením aktivit jednoho nebo více dalších komplexů dýchacího řetězce. Ve druhé části práce byly stanoveny referenční hodnoty pro aktivity komplexů dýchacího řetězce v izolovaných trombocytech u 161 mužů a žen ve věku mezi 0,5 a 35 roky. Ukázali jsme, že...
|
|
Klonování, detekce a analýza shluku genů pro syntézu antibiotika anthramycinu
Poubová, Martina ; Černá, Milena (vedoucí práce)
Cílem práce bylo najít, izolovat a sekvenovat shluk genů kódující syntézu anthramycinu, antibiotika ze skupiny pyrrolobenzodiazepinů, jehož producentem je Streptomyces refuineus var. thermotolerans. Pyrrolo[2,1-c] [1,4]benzodiazepiny jsou skupinou přirozeně se vyskytujících antibiotik s protinádorovým účinkem. Jsou to molekuly, které se kovalentně vážou do molekuly DNA a tím dochází k zablokování transkripce. Ačkoli anthramycin minimálně ovlivňuje kostní dřeň, nebyl uveden do klinické praxe jako protinádorové antibiotikum z důvodu vysoké kardiotoxicity. Lepší účinky a dobré klinické vlastnosti se očekávají od nových syntetických analogů a to jak ve smyslu protinádorových antibiotik, tak pro produkci antimikrobních látek a antimalarik. Doposud úspěšným antibiotikem z příbuzné rodiny antibiotik, linkosamidů, byl klindamycin s antibakteriálním i antiparazitickým účinkem. Znalost genového pozadí vzniku těchto látek umožňuje modifikaci současně užívaných látek a následnou finančně méně nákladnou produkci účinnějších a bezpečnějších látek. Pomocí molekulárně biologických metod byla izolována část chromozomální DNA producenta Streptomyces refuineus var. thermotolerans obsahující kompletní shluk genů pro biosyntézu anthramycinu.
|
|
Problematika závislosti na alkoholu u mladistvých
FILIPOVÁ, Darina
Z výzkumů zaměřených na problematiku závislosti na alkoholu prováděných závislých na alkoholu v České republice vyplývá, že se počet osob závislých na alkoholu každoročně zvyšuje a alkoholizmus je vážným problémem veřejného zdraví. Závislých rok od roku přibývá, dokládá to i to co uvedl 10. března 2010 pro deník Právo MUDr. Petr Popov primář oddělení pro léčbu závislostí Všeobecné fakultní nemocnice v Praze ? Dříve jsme měli zhruba 300 tisíc lidí závislých na alkoholu. Dnes je jich 600 až 700 tisíc. Přitom mužů je dvakrát víc než žen, ale ženy je rychle dohánějí.? Jak uvádí i článek z deníku Mladá Fronta Dnes ze dne 21. února 2012 mladých konzumentů alkoholu také přibývá a přitom nadměrné pití, pět a více skleniček nejméně třikrát měsíčně, přiznala asi pětina šestnáctiletých. Vyplývá to z výzkumu pro rok 2011, uvedeném ve zmíněném článku. Ve své diplomové práci, ve které se zabývám problematikou alkoholizmu mladistvých, bych chtěla zmapovat, jaký je problém alkoholizmu u mladistvých na Českobudějovicku a a zjistit úroveň jejich znalostí o zdravotních a sociálních důsledcích alkoholizmu. V teoretické části se věnuji obecně procesu a vzniku závislosti, problematice závislosti na alkoholu a sociálním a zdravotním důsledkům nadměrné konzumace alkoholických nápojů. Dále činitelům ovlivňujícím mladistvé v požívání alkoholu a jiných návykových látek a prevenci v oblasti závislostí zaměřené na mladistvé. Ve výzkumné části se věnuji konkrétně, socioekonomickému zázemí mladistvých respondentů, osobním zkušenostem s alkoholem a okrajově jinými návykovými látkami. Dále pak mapováním znalostí zdravotních a sociálních důsledků způsobených konzumací alkoholu, vlivem prostředí, komunit na vznik závislosti u mladistvých a tím jaké mají volnočasové aktivity. Využila jsem kvantitativního výzkumu, formou dotazníků. Z mého výzkumu vyplývá, že většina mladistvých si je vědoma následků užívání nebo nadužívání alkoholu, ale ve svém životě se v konzumaci alkoholických nápojů neomezují a ani je neuplatňují a konzumaci alkoholu s postupujícím věkem spíše zvyšují. K prevenci nadměrného užívání alkoholických nápojů, rozvoje závislosti u mladistvých a dalšímu rozšíření jejich vědomostí a dovedností využívaných v rámci snižování konzumace alkoholu prevence rozvoje následné závislosti by nepochybně mohla přispět edukace v oblasti krátké intervence rizikového pití alkoholu aplikovaná praktickým lékařem pro děti a dorost, cílené preventivní aktivity ve školách, edukace v rodinách a systematičtější využívání výcvikových seminářů, zaměřených na důslednější péči o osobně sociální rozvoj a lepší směřování volnočasových aktivit. Nepochybně by napomohlo i lepší legislativní opatření v postihování mladistvých uživatelů alkoholu a drog.
|
|
Improvement of retroviral vectors for efficient gene transfer
Šenigl, Filip ; Hejnar, Jiří (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent) ; Ruml, Tomáš (oponent)
Souhrnvýsledků Retrovirovévektory, kteréjsou sďropnéefektivně přenášetgenetickou informaci do cilových buněk a integrovď se do jejich DNd jsou velice užitečrrépro mnoho experimentri ďe poúý stabitnípřenos geirůještěnemuslbý dostačující.V expresi přenesenýchgenůhrají významnou roli takéepigenetickémodifikace. Exprese mužebý přerrršenajiž v momantě integrace DNA vektoru nebo můžedochrázetkpostupnémuvypinaní kopii vektoru během ďouhodobých experimentů.Rebovirové vektory se mohou ve stabilitě exprcse výzrramně lišit ďe posfupnémutranskripčnímuumlčováni poďéhají všechny. Proto je zapotřebí mďifikovat retovirové vektory za účelemstabilizace jejich exprese v ciloých buňkóch. stabi|ní expreseje důIeátrizejmerravoblasti genovéterapie,kde je opakovrini bansdukce častonemožnénebove|mi komplikované. Retrovirovévektory odvozenéod ASLV jsou v savčíchbuňkách velmi účinně umlčovárry.Testova|ijsme moŽnoststabilizovatexpresi těchto vektorůinzerci vnitřního elementuCpG ostrovu (IE). cpc ostrovyjsou aliímésvou schopnostiudržovatpřilehlé promotorytranskripčněaktivní'Konstruova|ijsme vnitřní elementCpG' ostrovagenu pro adenosinfosforibosyltransferrázuo déIcel20bp' Tentoe|ementbyl vloŽenv sensei antisense orientacido tříruznýchm|stuvnitř LTR (nazačátekoblastiU3, mezi enhancerya pÍomotora na začátekoblasti U5)' Týo vektory...
|
|
Apoptosis Signating Pathways and Biological Effects of TGFB
Šimáková, Olga ; Fuchs, Ota (vedoucí práce) ; Brdička, Radim (oponent) ; Holada, Karel (oponent)
Apoptosis is necessary for maintaing the integrity of all alive multicellular organisms and therefore needs to be precisely regulated. Very important regulators of apoptosis are pleiotropic cytokines from TFGβ superfamily (e.g. TGFβ, BMP, aktivins), whose signals are transduced by SMAD proteins. Patients with secondary myelodysplasias and acute myeloid leukemias (MDS/AML) frequently exhibit interstitial deletions of the chromosome-5q resulting in hemizygous loss of the transcription transactivator SMAD5. SMAD5 is a member of the signal transducer family conveying the pleiotropic TGFβ/BMP cytokine signals with roles in development, cell growth control, and tumor progression. Consistent Smad5 gene expression in these cell types and the gradual increase in its mRNA and protein levels in a model of induced erythroid differentiation of murine erythroleukemia (MEL) cells suggest a role of the gene in hematopoiesis. We show that bone morphogenetic protein 4 (BMP4) directs Smad5 activation in human hematopoietic cells, as monitored at the levels of protein phosphorylation, nuclear translocation, and specific transcription response. In vitro induction of normal human CD34+ cells by BMP4 results in significantly increased proliferation of erythroid progenitors (BFU-E) and formation of glycophorin- A+ cells, whereas...
|
|
Stanovení aktivity a exprese vybraných isoforem glutathion-S-transferasy v in vivo modelu glutamátem navozené obezity
Košťáková, Šárka ; Boušová, Iva (vedoucí práce) ; Skálová, Lenka (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Šárka Košťáková Školitel: doc. PharmDr. Iva Boušová, Ph.D. Název diplomové práce: Stanovení aktivity a exprese vybraných isoforem glutathion-S-transferasy v in vivo modelu glutamátem navozené obezity Obezita je chronické onemocnění s narůstající prevalencí v celosvětovém měřítku. Toto onemocnění je spojeno s patofyziologickými změnami v organizmu, jedna z nich je možný vliv na antioxidační obranu organizmu. Cílem této práce bylo stanovit specifickou aktivitu, proteinovou expresi a hladinu mRNA vybraných izoforem glutation-S- transferázy (GST) v cytozolu ledvin a srdcí myších samců kmene NMRI s obezitou navozenou opakovaným subkutánním podáním glutamátu sodného (MSG) a u zdravých kontrolních myší. Specifická aktivita byla stanovena spektrofotometrickou metodou za použití univerzálního a specifických substrátů. Proteinová exprese izoforem GST z rodin GSTA, GSTM a GSTP byla sledována pomocí denaturující akrylamidové elektroforézy a imunoblottingu. Hladina mRNA vybraných genů GST byla stanovena pomocí real-time PCR. V cytozolové frakci ledvin MSG myší byl pozorován nárůst celkové specifické aktivity GST (univerzální substrát) o 31 %, který byl provázen vzrůstem proteinové exprese izoformy GSTA...
|
host ::
