|
|
Identifikace nekódující RNA u Clostridium beijerinckii NRRL B-598 pomocí RNA-Seq dat
Pomykalová, Barbora ; Sedlář, Karel (oponent) ; Jurečková, Kateřina (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce obsahuje stručný úvod do problematiky nekódujících malých RNA u bakterií (sRNA). Zaměřuje se na jejich vlastnosti a funkce v organismu a to konktrétně pro bakterii Clostridium beijerinckii NRRL B-598. Dále obsahuje popis laboratorních metod pro stanovení genové exprese a navrhuje postup pro identifikaci malých nekódujících RNA z dat získaných metodou RNA-Seq, pro zkoumanou bakterii Clostridium beijerinckii NRRL B-598. V neposlední řadě dochází k implementaci navrženého postupu v prostředí MATLAB a zhodnocení výsledků získaných touto metodou.
|
|
|
The Role of oncogenic microRNA - 155 and proto - oncogen MYB in chronic lymphocytic leukemia
Vargová, Karina
(CZ) B-buněčná lymfocytární chronická lymfatická leukémie (B-CLL) představuje nádorové onemocnění, pro které je význačná akumulace B-buněk v periferní krvi, kostní dřeni, lymfatických uzlinách a slezině v důsledku poruchy programované smrti. Klinický průběh B- CLL je značně heterogenní, což dokazuje i fakt, že u některých pacientů toto onemocnění rychle progreduje, zatímco jiní pacienti přežívají několik let bez nutnosti léčby. I když se onemocnění charakterizuje stanovováním několika prognostických parametrů, jež jsou typické pro B-CLL, chybí spolehlivá indikace začátku včasné terapie. Z popsaného důvodu je v současnosti velice intenzivně studována nejenom biologická role malých nekódujících RNA (tzv. mikroRNA), ale také spojitost těchto molekul se vznikem a průběhem leukemických onemocnění včetne B-CLL. Proto jsme se zaměřili na studium miR-155, která reguluje diferenciaci buněk krvetvorby, zánětlivých reakcí a produkci protilátek. Zvýšená exprese miR- 155 se objevuje v leukemogenezi, kde se předpokládá, že má vliv na zástavu buněčné diferenciace a narušení normální funkce B-buněk. Naše výsledky potvrdily zvýšenou expresi jejího primárního transkriptu miR-155 a také maturované formy u pacientů s B-CLL. Analýza expresních dat kohorty 239 pacientů s B-CLL naznačuje, že vzorky pacientů s nepříznivou...
|
|
|
Profil lakasové aktivity v kulturách houby Trametes versicolor během degradace endokrinně disruptivní látky Delor 103
Plačková, Martina
V této práci byl studován endokrinně disruptivní potenciál Deloru 103 (směs kongenerů PCB) a jeho vliv na produkci a vlastnosti ligninolytického enzymu lakasy u houbové kultury Trametes versicolor. Byla prokázána androgenní aktivita Deloru 103 (EC50 = 2,29. 10-2 mg/l). Potenciální metabolity vznikající mikrobiální degradací této látky (chlorbenzoové kyseliny) vykazovaly estrogenní aktivitu, což naznačuje možné změny v hormonální aktivitě Deloru 103 v průběhu jeho mikrobiální degradace. Přítomnost Deloru 103 v kulturách T. versicolor v minerálním médiu stimulovala u houby vyšší produkci lakasy (až 257 krát), která vykazovala zároveň jiné izoformové složení než enzymy z kontrolních kultur. V komplexním médiu s Delorem 103 byla pozorovaná indukce produkce aktivního enzymu 64x nižší než u kultur rostlých v minerálním médiu. Dále bylo prokázáno, že indukce lakasy a produkce jejích různých forem závisela na stavu kultury v době přidání polutantu. Exponenciálně rostoucí kultury T. versicolor po přidání Deloru 103 produkovaly 7 různých pI forem lakasy, kdežto kultury v stacionární fázi růstu produkovaly pouze 4 formy o vyšším pI. Indukce lakasové aktivity u T. versicolor však nekorelovala s degradačním potenciálem kultur. Vyšší degradace (přibližně o 21 %) byla pozorována v kulturách rostlých v komplexním...
|
|
|
The role of evolutionarily conserved proteins BIR-1/Survivin and SKP-1 in the regulation of gene expression
Kostrouch, David ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Dráber, Pavel (oponent) ; Pacák, Karel (oponent)
Souhrn SKIP a BIR/Survivin jsou evolučně zachovalé proteiny. SKIP je známý transkripční a sestřihový kofaktor a BIR-1/Survivin reguluje bunečné dělení, genovou expresi a vývoj. Inaktivace SKP-1 a BIR-1 indukuje podobné vývojové fenotypy. K odhalení možných interakcí SKP-1 a BIR-1 jsme použili kvasinkový dvojhybridní systém a knihovnu kompletní mRNA C. elegans. Tyto experimenty identifikovaly částečně se překrývající kategorie proteinů jako interaktory proteinů SKP-1 a BIR-1. Identifikované interagující proteiny zahrnovaly ribozomální proteiny, transkripční faktory, translační faktory, cytoskeletální a motorové proteiny. Tyto výsledky naznačují jejich možnou účast v mnohočetných proteinových komplexech. Pomocí krátkodobé nadměrné exprese BIR-1 jsme sledovali účinek BIR-1 na proteom C. elegans v larválním stádiu L1. To způsobilo dramatickou změnu v celém proteomu což naznačuje, že BIR-1 má schopnost změnit chromatografický profil mnohočetných cílových proteinů včetně těch, které jsme již dříve identifikovali jako interagující proteiny v experimentach s kvasinkovým dvouhybridním systému. Výsledky jsme následně potvrdili pro RPS-3, RPL-5, myosin (non-muscle myosin) a TAC-1 (transkripční kofaktor a protein asociovaný s centrosomy). Tyto výsledky naznačují, že SKP-1 a BIR-1 jsou multifunkční proteiny, které jsou...
|
|
|
Regulatory mechanisms of ornithin transcarbamylase and beta-glucocerebrosidase gene expression and their relevance to diagnostics
Lukšan, Ondřej ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Kožich, Viktor (oponent) ; Kříž, Vítězslav (oponent)
4 Abstrakt Konečná diagnóza d dičných metabolických poruch je obvykle určena na základ vyšet ení enzymové aktivity (což je mnohdy komplikované) a/nebo za pomoci molekulárn genetického vyšet ení. Výsledky standardní mutační analýzy však mohou být n kdy zavád jící, zejména v p ípad rozsáhlých reorganizací na úrovni chromozomu či u mutací v regulačních oblastech. P edkládaná práce je zam ena na charakterizaci komplexních mutací v genu pro ornitin transkarbamylázu (OTC), studium regulačních oblastí OTC a genu pro β-galaktozidázu (GBA). V rámci studie provedené na souboru čítajícím 37 pacient s kongenitální hyperamonémií II. typu (OTCD) bylo identifikováno a charakterizováno 14 nových mutací včetn t í rozsáhlých delecí. Byl zaznamenán i p ípad symptomatické heterozygotky pro hypomorfní mutaci p.R129H, u níž byl fenotyp OTCD z ejm podmín n posunem v X-inaktivaci ve prosp ch mutované alely. Nález byl podložen sledováním nevýhodné X-inaktivace ve t ech r zných periferních tkáních. Za účelem prov ení patogenity promotorové variace c.-366A>G v OTC nalezené v jedné rodin s mírným fenotypem OTCD byly identifikovány t i alternativní počátky transkripce (PT) a vymezen promotor lidského OTC. Transkripční aktivita promotoru, stejn tak jako aktivita nov nalezeného distálního enhanceru, byla ov ena funkční esejí. Výsledky...
|
|
|
Laboratorní diagnostiky mikrometastáz u pacientek s karcinomem prsu
Mikulová, Veronika ; Zima, Tomáš (vedoucí práce) ; Svoboda, Marek (oponent) ; Průša, Richard (oponent)
Úvod: Přítomnost cirkulujících nádorových buněk (CTC) v periferní krvi je asociována s horší prognózou a časným relapsem u pacientek s karcinomem prsu. Stanovení přítomnosti CTC v periferní krvi je nyní považováno za tzv. tekutou biopsii. Cílem této práce bylo stanovení přítomnosti CTC a jejich molekulární charakterizace s potenciálním využitím nejen jako nový biomarker pro sledování účinnosti systémové terapie ale také jako vhodný nástroj pro stratifikaci pacientek a následnou individualizaci léčby karcinomu prsu. Metody: Do prospektivní studie bylo zařazeno 54 pacientek s časným karcinomem prsu. Opakovaně jsme odebírali 10ml periferní krve pro stanovení přítomnosti a charakterizaci CTC v průběhu léčby. Izolace a detekce CTC byla provedena za použití AdnaTest BreastCancer™ kitu (AdnaGen AG, Německo) využívající kombinaci imunomagnetické separace s multiplex PCR pro stanovení transkriptů epiteliálních a tumor-asociovaných genů (EpCAM, MUC1 a HER2) v lyzátu CTC. Následně byla cDNA z izolovaných CTC použita pro analýzu genových expresí TOP1, TOP2A, CSTD, ST6GAL, KRT19 a aktin pomocí nově navržených a optimalizovaných esejí pomocí kvantitativní PCR (qPCR). Výsledky qPCR byly analyzovány pomocí softwaru Genex (MultiD Analysis). Výsledky: Celkem jsme vyšetřily 195 vzorků periferní krve. Přítomnost CTC...
|
|
|
Exprese WT1 a jeho sestřihových variant v myeloidních leukémiích
Macháčková Lopotová, Tereza
2 Abstrakt Myeloidní leukémie představují maligní onemocnění charakterizovaná expanzí myeloidní krevní řady. Zatímco v případě chronické myeloidní leukémie (CML) je hlavní příčina onemocnění známa - t(9;22) a aktivita fuzního produktu BCR-ABL, s akutní myeloidní leukémií (AML) je spojena řada translokací a mutací. Cílem této práce je přispět ke zlepšení monitorování pacientů s myeloidními leukémiemi cestou detailního poznání exprese panleukemického markeru, genu Wilmsova tumoru (wt1). Prognostický význam celkové exprese wt1 je znám u pacientů s AML, nebyl ale jednoznačně potvrzen pro pacienty s CML. O expresi jednotlivých izoforem (celkem více než 36 proteinových produktů) existují velmi kusé informace v případě obou diagnóz i zdravé hematopoézy. Většina této práce je soustředěna na CML, AML je věnována pouze omezená část. V rámci první části jsme prokázali vysoký prognostický význam celkové exprese mRNA wt1 pro pacienty s CML. Statistická hodnocení ukázala kritické hladiny wt1, které umožňují v porovnání s rutinně používaným markerem, hladinou transkriptu bcr-abl, upřesnit prognózu pacientů, kteří neodpovídají optimálně na léčbu. Dále jsme navrhli a optimalizovali reverzně transkriptázové PCR v reálném čase pro kvantifikaci vybraných variant wt1 (kombinace sestřihu exonu 5 a KTS sekvence, swt1 vs. wt1 plné...
|
|
|
Vliv mastných kyselin na lipidový metabolismus a redukci tělesné hmotnosti
Hlavatý, Petr ; Kunešová, Marie (vedoucí práce) ; Müllerová, Dana (oponent) ; Flachs, Pavel (oponent)
Tuková tkáň hraje ústřední roli ve vývoji metabolického syndromu. Řada složek metabolického syndromu může být zlepšena dietními opatřeními, včetně zvýšeného příjmu PUFA řady n-3. Vedle efektu PUFA řady n-3 se již dlouhou dobu diskutuje i o možném vlivu vyššího příjmu vápníku na ovlivnění redukce hmotnosti a energetického metabolismu. Vedle nutričních faktorů se však na ovlivnění hmotnosti a lipidového a glukózového metabolismu významnou měrou podílejí i genetické faktory. Ve studii A bylo sledováno 40 obézních žen během 3týdenního redukčního režimu. Sledované ženy byly náhodně rozděleny do 2 skupin. První skupina dostávala jogurty obohacené PUFA řady n-3, druhá konzumovala jogurty bez suplementace. Výsledky ukazují, že suplementace nízkou dávkou PUFA řady n-3 v jogurtu v kombinaci s nízkokalorickou dietou zvyšuje podíl PUFA řady n-3 v sérových lipidech a zabraňuje nepříznivým změnám ve složení FA v séru po krátkodobé nízkokalorické dietě. Ve studii B jsme sledovali vliv suplementace PUFA řady n-3 při krátkodobém redukčním režimu s VLCD u dvaceti žen s těžkou obezitou, které byly náhodně rozděleny do dvou skupin. První skupina dostávala VLCD obohacenou o PUFA řady n-3, druhá skupina VLCD s placebem. Přidání PUFA řady n-3 rybího původu k velmi přísné nízkoenergetické dietě mělo za následek větší redukci BMI a...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Mráz, Marek (oponent)
Markéta Sypecká Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. Každá fáze tohoto onemocnění má však významně vyšší hladinu miR-155, která je známá jako oncomiR. Mikro RNA představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů CLL B - buněk odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metoda, kterou používáme pro editaci genů, je CRISPR / Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci zralého miR-155 v genomu leukemických B-buněk. Metody: CRISPR/Cas9, nukleofekce, qRT-PCR, FACS Výsledky: Podařilo se nám izolovat klon, který nese jednu alelickou deleci (miR-155 - / +) v sekvenci pro zralou miRNA-155; určete změny exprese v sadě validovaných cílů miRNA-155 v...
|
|
|
Factors affecting gene expression in Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Vohradský, Jiří (oponent)
Klíčovým enzymem bakteriální transkripce je DNA-závislá RNA-polymeráza (RNAP). Její aktivita musí být přesně kontrolována. Tato kontrola může nastat na úrovni rozeznání různých verzí promotorové DNA, v různém stavu nadšroubovicovitého vinutí. Dále také pomocí změn ve vnitrobuněčné koncentraci metabolitů, nebo pomocí vazby proteinů, které se nazývají transkripční faktory. I když byla RNAP a její regulační síť intenzivně studována po desítky let, stále nové a nové regulátory jsou objevovány. Hlavním cílem této doktorské práce je představit několik z nich: i) HelD, nový protein, který se váže na RNAP, a jehož trojrozměrná struktura zatím není známa; ii) RNázu J1, enzym s novým mechanismem funkce; iii) Spx, důležitý regulátor genové exprese v Bacillus subtilis, jehož všechny funkce zatím nejsou popsány a iv) vliv nadšroubovicovitého stavu promotorové DNA na transkripci. V Publikaci I jsme popsali HelD protein jako nového vazebného partnera RNAP z Bacillus subtilis a charakterizovali jsme jeho biochemické vlastnosti. HelD zvyšuje transkripci tím, že pomáhá recyklovat molekuly RNAP, a tato aktivace je závislá na ATP. V Publikaci III jsme prezentovali první vhled do trojrozměrné struktury HelD pomocí metody SAXS a popsali jsme doménové složení HelD proteinu. A v Publikaci VI jsme vyřešili strukturu...
|
host ::
RSS.