|
Vliv endokrinních disruptorů na funkčnost spermií a změny ve steroidogenezi transkriptomik u ryb
HATEF, Azadeh
In the present study, both in vitro and in vivo experiments were performed to investigate modes of action of selected EDCs including mercury chloride (HgCl2), bisphenol A (BPA), vinclozolin (VZ) and Di-(2-ethylhexyl)-phthalate (DEHP) on male reproductive physiology in fish. Results obtained from in vitro studies showed that EDCs decrease sperm motility via disruption in energetics and damage to spermatozoa; however the effective doses are higher than reported in the environmentally relevant concentrations. In contrast, in vivo studies showed adverse effects of BPA, VZ, and DEHP on sperm quality at environmentally relevant concentrations. Decrease in sperm quality is associated with disruption in testicular steroidogenesis, particularly inhibition of androgens. Only BPA induced vitellogenin production, associated with increase in transcripts of estrogen receptor, androgen receptor and cytochrome P450 mRNA at the high dose approaching environmental level. Inhibition of androgen production is due to disruption in transfer of cholesterol into the steroidogenesis pathway, because transcript of steroidogenic acute regulatory protein mRNA was decreased. In addition, BPA acts through sex steroid-mediated mechanism while DEHP mode of action is sex-steroid independent mechanism.
|
|
Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru
Vít, Ondřej ; Němečková, Šárka (oponent) ; Forstová, Jitka (vedoucí práce)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní Nkoncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým alfa-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní...
|
|
Eukaryotic and prokaryotic nitric oxide synthase - structure-function studies
Mikula, Ivan ; Martásek, Pavel (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Král, Vladimír (oponent)
Oxid dusnatý (NO) patří mezi nejdůležitější signální molekuly organismů, kde hraje zásadní roli v širokém spektru fyziologických a patologických procesů, včetně vazodilatace, přenosu nervového signálu a imunitní odpovědi organismu. Tato plynná molekula je produktem oxidační reakce katalyzované rodinou syntáz oxidu dusnatého (NOS).U savců byly identifikovány tři izoformy NOS, endoteliální (eNOS), neuronální (nNOS) a inducibilní, nebo také imunologická (iNOS). Některé bakterie nesou geny kódující proteiny homologní s oxygenázovou doménou savčích NOS a vykazující NO-syntázovou aktivitu in vitro. Předpokládá se, že NO tvořený patogenními organismy jako je B. anthracis nebo S. aureus by mohl hrát kritickou roli v patofyziologickém průběhu infekce. Komparativní studie bakteriálních "NOS-like" enzymů a savčích NOS prokázala jejich základní podobnost a zároveň rozdíly mezi jednotlivými bakteriálními proteiny i savčími izoformami při interakcích s různými analogy substrátu L-argininu a dalšími ligandy. Na základě výsledků měření kinetiky zpětné vazby NO byla predikována přítomnost druhého NO-vazebného místa v aktivním centru některých NOS. Dále byla popsána regulace dynamiky a uvolňování NO z proteinu NOS pomocí sítě vodíkových vazeb mezi hemovou prostetickou skupinou, substrátem a kofaktorem BH4. Nitrity (NO2 -)...
|
|
Preparation of cDNA of selected gene and cloning.
Bogdanovič, Igor ; Miletín, Miroslav (vedoucí práce) ; Bunček, Martin (oponent)
Abstrakt
ABC jsou velká skupina transmembránových proteinů, o kterých je známo že hrají klíčovou roli v rozvoji lékové rezistence. Schopnost těchto proteinů aktivně transportovat širokou škálu látek ven z buňky je hlavním principem - schopnosti řady nádorových buněk odolávat působení chemoterapeutik. Pro studium aktivity lékových transportérů a jejich substrátů či inhibitorů bylo vyvinuto množství in vitro modelů. Tyto modely jsou založeny na využití savčích buněk, které jsou geneticky manipulovány tak, aby v plazmatické membráně exprimovaly vybraný efluxní transportér. Pro genetické modifikace těchto buněk se využívá řada produkčních plazmidů. V naší práci jsme se zaměřili na vývoj univerzálního produkčního plazmidu obsahujícího krátkou V5 tag sekvenci a umožňujícího následné vklonování kódující sekvence vybraného lékového transportéru tak, aby byl V5 tag lokalizován na jeho 3' konci. Výsledný produkční plazmid tak může být dále použit k transfekci vhodné savčí buněčné linie, která bude sloužit jako model pro studium aktivity efluxního transportéru in vitro. Vybraný transportér je v buněčné linii produkován jako fúzní protein s V5 tagem lokalizovaným na jeho C-konci. Tak může tento tag sloužit jako univerzální marker proteinové exprese detekovatelný s pomocí imunohistochemických metod. Pro konstrukci V5...
|
|
Aktin a jeho regulace v klatrinové endocytóze
Pešanová, Denisa ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Janštová, Vanda (oponent)
3 Abstrakt Aktinová vlákna a jejich dynamika hrají důležitou roli při přestavbě povrchu eukaryotických buněk. Regulační proteiny aktinu mají významný vliv na řízení aktinové dynamiky. Během klatrinové endocytózy se na plazmatické membráně stýkají aktin a regulační proteiny s klatrinem a adaptorovými proteiny, aby se společně podílely na vchlípení membrány a odštěpení váčku. Aktinové struktury jsou zásadní pro vznik, internalizaci i pohyb endocytovaných váčků u kvasinek. U savčích buněk ještě není účast aktinu zvláště v časných fázích endocytózy dobře objasněna. I přes využití nejmodernějších zobrazovacích metod neexistují ustálené modely ukazující zřejmě odlišné role aktinu v klatrinové endocytóze u kvasinek a v savčích buňkách. Tato práce se snaží nalézt soulad kontroverzních výsledků nedávných studií a komplexnosti procesu regulace aktinu. Předkládá shrnutí současných hypotéz a mechanismy interakcí nejvýznamnějších proteinů, které ovlivňují dynamiku aktinu v procesu klatrinové endocytózy. Klíčová slova aktin, klatrinová endocytóza, Saccharomyces cerevisiae, regulační proteiny
|
|
Biochemical and molecular studies of cytochrome c oxidase and ATP synthase deficiencies
Fornůsková, Daniela ; Zeman, Jiří (vedoucí práce) ; Hyánek, Josef (oponent) ; Stiborová, Marie (oponent)
Mgr. Daniela Fornůsková Disertační práce Studium poruch cytochrom c oxidasy a ATP synthasy na biochemické a molekulární úrovni ABSTRAKT Savčí organismus je plně závislý na systému oxidativní fosforylace (OXPHOS) jako hlavním zdroji produkce energie (ATP) v buňce. Poruchy OXPHOS mohou být způsobeny mutacemi v genech kódovaných mitochondriální DNA nebo jadernou DNA. Část výzkumné práce je zaměřena na roli raně a pozdně se asemblujících, jaderně kódovaných, strukturních podjednotek cytochrom c oxidasy (CcO) a Oxa1l, lidského homologu kvasinkové mitochondriální Oxa1 translokasy, v biogenezi cytochrom c oxidasy a její funkci s využitím stabilní RNA interference COX4, COX5A, COX6A1 a OXA1L a ektopické exprese epitopově značených podjednotek Cox6a, Cox7a a Cox7b v buněčné linii HEK (lidské embryonální ledviny)-293. Naše výsledky ukazují, že zatímco podjednotky Cox4 a Cox5a jsou nezbytné pro asemblaci funkčního komplexu CcO, Cox6a podjednotka je důležitá pro její stabilitu. V buňkách se sníženou expresí OXA1L byla překvapivě zjištěna normální aktivita i hladina holoenzymu CcO, přestože inaktivace OXA1 u kvasinek vyvolá kompletní ztrátu aktivity CcO. Při studiu poruch OXPHOS v izolovaných mitochondriích kosterního svalu, srdce, jater a frontálního kortexu získaných od pacientů s Leigh syndromem (mtDNA mutace...
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
|
Vliv tetrabrombisfenolu A (TBBPA) na reprodukční parametry, spermatogenezi a aktivitu vybraných genů u myší in vivo.
Žatecká, Eva ; Pěknicová, Jana (vedoucí práce) ; Kovář, Jan (oponent)
4 Abstrakt: Tetrabrombisfenol A je látka, které je využívána v průmyslu jako zpomalovač hoření. V současné době patří k těm nejpoužívanějším, jeho spotřeba činí 210 000 tun/rok a stále roste. Bylo prokázáno, že TBBPA se může uvolňovat do prostředí, byl nalezen v životním prostředí a dokonce i v lidském těle. Byly prokázány negativní účinky TBBPA na různé buněčné linie in vitro včetně TM4 Sertoliho buněk. Dále bylo prokázáno, že je schopen ovlivnit thyroidní hormonální systém a předpokládá se, že by mohl být schopen ovlivnit i androgení/estrogení hormonální systém. Z těchto důvodů byl TBBPA zařazen na seznam látek potencionálně nebezpečných lidskému zdraví. V této studii byl studován vliv TBBPA na reprodukční parametry, spermatogenezi a aktivitu vybraných genů na myších in vivo. Nejprve byla provedena dvougenarační studie na outbrední myší linii - CD1. U experimentálních zvířat byl detekován zvýšený počet apoptotických buněk v testes a dále byla zjištěna změna exprese u genů kódujících vybrané proteiny, které hrají důležitou roli během spermatogeneze. Naproti tomu kvalita spermií a reprodukceschopnost myší ovlivněných látkou TBBPA ovlivněny nebyly. Jako dodatková studie byla provedena jednogenerační in vivo studie na inbrední myší linii - C57BL/6. Tato studie převážně potvrdila výsledky obdržené z předešlé...
|
|
Funkční analýza kvality spermií po působení vybraných endokrinních disruptorů
Linhartová, Zuzana ; Liberda, Jiří (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Cíl Cílem mé práce bylo zjistit, zda vybrané endokrinní disruptory (EDs) mají vliv na reprodukční parametry spermií. Moje práce se díky dvěma experimentálním modelům, na kterých byl zkoumán vliv vybraných ED, dělí na dvě části: A) pokusy na praseti divokém (Sus scrofa), B) pokusy na okounu říčním (Perca fluviatilis L.). A) Na kančím modelu byl testován vliv vybraných EDs (zearalenone (ZEN), di(2-ethylhexyl) ftalát (DEHP), vinklozolin (VIN) na průběh kapacitace, akrosomální reakce in vitro a změny v detekci a lokalizaci vybraných proteinů. B) Na rybím modelu byl zkoumán vliv vybraného ED bisfenol A (BPA) na motilitu a rychlost pohybu rybích spermií Výsledky Savčí model U savčího modelu zkoumané EDs průkazně ovlivňovaly průběh kapacitace i akrosomální reakci ve srovnání s kontrolními vzorky. Metodou průtoková cytometrie jsem prokázala nárůst počtu značených buněk v průběhu kapacitace a snížení počtu značených buňek po AR a porovnala rozdíly mezi experimentálními vzorky a kontrolními. Ve vyšších koncentracích EDs jednoznačně potlačovaly akrosomální reakci a tudíž snižovaly počet spermií schopných oplození. Vypovídací schopnost výsledků detekce akrosomální reakce byla potvrzena využitím různých metodických přístupů (imunofluorescence, imunodetekce, SDS elektroforéza, chlotetracyklinová analýza). Rybí model U...
|
|
Diabetes mellitus negatively affects male reproductive parameters in vivo
Valášková, Eliška ; Žatecká, Eva ; Pavlínková, Gabriela ; Bohuslavová, Romana ; Dorosh, Andriy ; Elzeinová, Fatima ; Kubátová, Alena ; Margaryan, Hasmik ; Pěknicová, Jana
According to the World Health Organization (WHO), 15% of couples in reproductive age suffer from infertility problems, and up to 60% of cases are caused by male factor. This could be caused by genetic background, environmental factors and various diseases, including diabetes mellitus (DM). However, the impact of DM on male fertility is not fully understood. . The aim of this study was to investigate the effects of DM on reproductive parameters and sperm quality, using mouse model. DM (type 1) was induced by Streptozotocin in FVB inbred mouse strain. Mice with blood sugar levels higher than 13.9 mmol/L were considered diabetic. After 4 weeks of diabetes exposure, diabetic males were bred with wild type females and transgenerational effect of DM was assessed. Selected morphological, cellular, and molecular parameters of diabetic males and their male offspring were compared to appropriate controls. There was an increased in sperm fragmentation and abnormalities of sperm morphology in diabetic mice in both generations. An increased staining with apoptotic marker annexin V was also detected in the diabetic groups. Furthermore, a presence of protamines as major sperm nuclear proteins was analysed. Protamine 1 to protamine 2 ratio (P1/P2), a marker of male fertility, was altered in sperms of experimental diabetic animals in both generations. Our findings indicate that DM type 1 negatively affects sperm quality and P1/P2 ratio and this negative effect is transmitted to the progeny
|
host ::
