|
|
Inducibilní expresní systémy a jejich využití ve studiu parazitických organismů.
Horáčková, Vendula ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
1 Abstrakt Inducibilní expresní systémy jsou systémy, které umožňují ‚zapínat' a ‚vypínat' expresi genu zájmu, a jsou tedy užitečným nástrojem pro studium funkce genů. Existují desítky různých inducibilních expresních systémů, které se navzájem liší úrovní, na které k indukci dochází, dobou indukce, možnostmi využití atd. V této práci budou popsány tři typy inducibilních expresních systémů, na kterých budou demonstrovány obecné rysy systémů regulovaných na úrovni transkripce. Jsou to systémy založené na regulaci lac operonu Escherichia coli, dále systémy využívající regulačních elementů transpozonu Tn10 E. coli, které jsou zodpovědné za rezistenci vůči tetracyklinu, a nakonec systémy regulované agonisty receptoru pro steroidní hormon ekdyson, který je klíčovým regulátorem vývoje hmyzu. Práce obsahuje i kapitolu o využití inducibilních expresních systémů u parazitických organismů.
|
|
|
Optimalizace exprese fotoaktivovatelných cytochromů P450 jako nano-sond pro studium membránové topologie enzymů metabolismu léčiv a aktivace karcinogenů
Smolová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P450 patří mezi jedny z nejdůležitějších enzymů podílejících se na biotransformaci cizorodých látek v organismu. Jsou součástí tzv. moooxygenasového systému, ve kterém interagují s dalšími enzymy - NADPH:cytochrom P450 reduktasou a cytochromem b5. Vzájemné interakce enzymů v mooxygenasovém systému nejsou zcela rozřešeny. K objasnění možných protein-proteinových interakcí a jejich důsledků by mohla přispět technika kovalentního síťování. Jednou z možností realizace tohoto záměru je využití fotoaktivovatelného cytochromu P450, který by po expozici UV záření vytvořil kovalentní komplex se složkami monooxygenasového systému, s nimiž je v kontaktu. Tato práce se proto zabývá vypracováním optimálních podmínek pro produkci rekombinantního cytochromu P450 2B4 s cílem získat poznatky pro produkci fotoaktivovatelného cytochromu P450 s inkorporovanými aminokyselinami L-fotomethioninem a L- fotoleucinem. V provedených experimentech byl cytochrom P450 2B4 exprimován ve dvou kmenech Escherichia coli, C41 (DE3) a BL21 (DE3) Gold, a ve dvou kultivačních nádobách, skleněné Erlenmayerově baňce a plastové Fernbachově baňce. V průběhu exprese byla měřena optická denzita bakteriální suspenze (absorbance při 600 nm) a koncentrace cytochromu P450. Byla vypracována metodika stanovení koncentrace cytochromu P450...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Study of the variations in the expression of different adhesion and cytoskeletal proteins of podocytes (E-Cadherin, Podocin, Vimentin) due to Bisphenol A
Chvojanová, Zuzana ; Kovařík, Miroslav (vedoucí práce) ; Němečková, Ivana (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd The University of Alcalá, Faculty of Medicine, Department of biomedicine and biotechnology Student: Zuzana Chvojanová Školitel: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Konzultant: María Isabel Arenas Jimenéz Název diplomové práce: Studie změn v expresi různých adhezivních a cytoskeletálních proteinů podocytů (E-kadherin, Podocin, Vimentin) v důsledku Bisfenolu A Bisfenol A (BPA) patří mezi nejrozšířenějsí sloučeniny na světě, jehož produkce činí ročně vice než 6 miliard tun. Je široce používaný jako součást polykarbonátových plastů a epoxidových pryskyřic, z nichž jsou vyráběny znovu použitelné plastové lahve, potravinové boxy a některé lékařské vybavení. Také se používá k potažení vnitřní vrstvy plechovek. V dříve provedených studiích bylo zjištěno, že BPA v lidském organismu přispívá ke vzniku mnoha chronických onemocnění jako například onemocnění ledvin - diabetická nefropatie. Podocyty - terminálně diferenciované buňky Bowmanova pouzdra glomerulu - jsou nedílnou součástí filtrační bariéry, kde hrají důležitou roli v zabránění průniku plasmatických proteinů do moči. Proto jsme se v této studii zaměřili na efekt BPA právě na tyto buňky a jejich konkrétní proteiny, a to pomocí in vivo a in vitro metod....
|
|
|
Study of the variations in the expression of different adhesion and cytoskeletal proteins of podocytes (E-Cadherin, Podocin, Vimentin) due to Bisphenol A
Chvojanová, Zuzana ; Kovařík, Miroslav (vedoucí práce) ; Němečková, Ivana (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd The University of Alcalá, Faculty of Medicine, Department of biomedicine and biotechnology Student: Zuzana Chvojanová Školitel: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Konzultant: María Isabel Arenas Jimenéz Název diplomové práce: Studie změn v expresi různých adhezivních a cytoskeletálních proteinů podocytů (E-kadherin, Podocin, Vimentin) v důsledku Bisfenolu A Bisfenol A (BPA) patří mezi nejrozšířenějsí sloučeniny na světě, jehož produkce činí ročně vice než 6 miliard tun. Je široce používaný jako součást polykarbonátových plastů a epoxidových pryskyřic, z nichž jsou vyráběny znovu použitelné plastové lahve, potravinové boxy a některé lékařské vybavení. Také se používá k potažení vnitřní vrstvy plechovek. V dříve provedených studiích bylo zjištěno, že BPA v lidském organismu přispívá ke vzniku mnoha chronických onemocnění jako například onemocnění ledvin - diabetická nefropatie. Podocyty - terminálně diferenciované buňky Bowmanova pouzdra glomerulu - jsou nedílnou součástí filtrační bariéry, kde hrají důležitou roli v zabránění průniku plasmatických proteinů do moči. Proto jsme se v této studii zaměřili na efekt BPA právě na tyto buňky a jejich konkrétní proteiny, a to pomocí in vivo a in vitro metod....
|
|
|
Příprava Oryzasinu 1 pro štěpení proteinů v experimentech vodík/deuteriové výměny.
Šintáková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Jurnečka, David (oponent)
Vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS) je stále populárnější technikou strukturní biologie. Její prostorové rozlišení závisí na účinnosti fragmentace nebo proteolytickém štěpení studovaného proteinu. Z toho důvodu je snaha hledat nové proteasy, které by nejen byly schopné štěpit zkoumaný protein při podmínkách HXMS, ale také poskytovaly co největší pokrytí sekvence proteinu. Tato práce se zabývá nalezením optimálních podmínek produkce aspartátové proteasy Oryzasinu 1 pro potenciální použití v experimentech HXMS. Z dostupných plazmidů byly vybrány vhodné produkční klony, pomocí peptidového mapování byla ověřena identita produkovaného proteinu a následně byly nalezeny vhodné produkční podmínky. Na základě těchto výsledků bylo přistoupeno k produkci proteinu ve velkém objemu a k izolaci inkluzních tělísek. Klíčová slova: Oryzasin 1, proteasy, vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS)
|
|
|
Inducibilní expresní systémy a jejich využití ve studiu parazitických organismů.
Horáčková, Vendula ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
1 Abstrakt Inducibilní expresní systémy jsou systémy, které umožňují ‚zapínat' a ‚vypínat' expresi genu zájmu, a jsou tedy užitečným nástrojem pro studium funkce genů. Existují desítky různých inducibilních expresních systémů, které se navzájem liší úrovní, na které k indukci dochází, dobou indukce, možnostmi využití atd. V této práci budou popsány tři typy inducibilních expresních systémů, na kterých budou demonstrovány obecné rysy systémů regulovaných na úrovni transkripce. Jsou to systémy založené na regulaci lac operonu Escherichia coli, dále systémy využívající regulačních elementů transpozonu Tn10 E. coli, které jsou zodpovědné za rezistenci vůči tetracyklinu, a nakonec systémy regulované agonisty receptoru pro steroidní hormon ekdyson, který je klíčovým regulátorem vývoje hmyzu. Práce obsahuje i kapitolu o využití inducibilních expresních systémů u parazitických organismů.
|
|
|
The analysis of structural details of the NMDA receptor
Radilová, Kateřina ; Balík, Aleš (vedoucí práce) ; Jakubík, Jan (oponent)
NMDA receptor je nezbytnou součástí exitační transmise v centrální nervové soustavě. Pozměněná funkce NMDA receptorů je spojována s mnoha neurodegenerativními a neuropsychiatrickými chorobami. Vyřešené krystalové struktury NMDA receptorů znamenaly velký posun v pochopení detailů jejich funkce. Bohužel tyto v současnosti dostupné struktury představují jen některé funkční stavy receptoru a také několik strukturních informací stále chybí. Ke kompletnímu porozumění procesu aktivace a deaktivace NMDA receptorů je potřeba doplnit stávající informace dalšími studiemi. Cílem této práce bylo pomocí kombinace různých metod (počítačové modelování, klonování, biochemické metody, exprese a purifikace proteinu a strukturní hmotnostní spektrometrii) získat nová strukturní data, kterými bychom byli schopni doplnit mezery v současnosti dostupných modelech a strukturách receptoru, zejména pak receptoru v různých funkčních stavech. Klíčová slova NMDA receptor, glutamátový receptor, počítačové modelování, struktura, klonování, exprese proteinu
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Studium molekulární organizace systému cytochromu P450 pomocí fotoaktivovatelných proteinů
Dědič, Jan ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Systém cytochromu P450 je velmi významný z hlediska metabolismu endogenních látek a xenobiotik. Tento systém se skládá z cytochromu P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy (CPR), cytochromu b5 a NADH:cytochrom b5 reduktasy (CYB5R3). Objasnění protein-proteinových interakcí mezi jeho částmi je nezbytné pro pochopení fungování celého systému. Metoda kovalentního síťování se jeví jako velmi vhodná pro studium těchto interakcí. V této práci byl použit fotoaktivovatelný analog aminokyseliny L-methioninu (L-foto-methionin) jako síťovací činidlo. Tato práce se zabývá organickou syntézou L-foto-methionu, expresí a izolací CPR a CYB5R3 jako fotoaktivovatelných proteinů s inkorporovaným L-foto-methioninem. Pro expresi byl použit auxotrofní kmen E.coli B834 (DE3) a M9 miminální medium. Úspěšně byla exprimována a izolována CYB5R3 s inkorporovaným L-foto-methioninem. Míra inkorporace byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Dále byla testována schopnost síťování CYB5R3 s cytochromem b5. Klíčová slova: fotolabilní aminokyseliny, exprese proteinů, syntéza
|
host ::
RSS.