|
| |
|
|
Crosstalk of PKN3 and p130Cas/BCAR1 signaling
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Voller, Jiří (oponent)
Ako p130Cas, tak PKN3, sú dôležitými regulátormi bunkovej signalizácie, ktorej deregulácia vedie k malignému rastu nádorových buniek. Nedávno sme v našom laboratóriu zistili, že prostredníctvom SH3 domény p130Cas dochádza k interacii s polyprolínovým motívom PKN3, naznačujúc ich potenciálnu úlohu v spoločnej regulácii týchto procesov. V rámci tejto práce sme sa zamerali na fosforyláciu p130Cas kinázou PKN3 a potvrdili sme, že serín 498 (S498) vyskytujúci sa v SRD p130Cas je PKN3 fosforylovaný in vitro. Vzhľadom k tomu, že S498 sa nachádza vo väzbovom motíve pre proteíny 14-3-3 a jeho fosforylácia je pre interakciu p130Cas so 14-3-3 vyžadovaná, navrhli sme potenciálne novú signálnu dráhu, a to PKN3/p130Cas/14-3-3. V druhej časti práce sme študovali odpoveď tejto dráhy na pôsobenie antiestrogénov v nádorových bunkách línie MCF7, pozitívnych na estrogénové receptory. Napriek tomu, že sme ukázali, že v rámci skorej odpovede na pôsobenie tamoxifénu dochádza k inaktivácii PKN3, nevylučujeme jej neskoršiu úlohu v procese vzniku antiestrogénovej rezistencie. Navyše, objasnenie signalizácie stimulovanej interakciou p130Cas s PKN3 a jej možného vplyvu na maligný rast nádorových buniek by mohlo prispieť k návrhu nových terapeutických cieľov.
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Dráber, Petr (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Posttranslational modifications affecting function of nuclear localization signal
Šebrle, Erik ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Venit, Tomáš (oponent)
Transport proteinů do jádra přes jadernou blánu je kontrolovaný převážně prostřednictvím jaderné lokalizační sekvence/signálu (NLS). Jaderný lokalizační signál je bohatý na pozitivně nabyté aminokyseliny arginin a lysin. Bylo zjištěno, že aktivita tohoto jaderného lokalizačního signálu může být regulována prostřednictvím fosforylace serinu v jeho těsné blízkosti. Fosforylace serinu nebo fosfomimetické změny těchto presekvencí (NLS) může představovat důležitý mechanismus regulující lokalizaci proteinu v buňkách v závislosti na jejich buněčné aktivaci. V naší laboratoři byl identifikován protein - Fragile X mental retardation syndrome 1 neighbor (Fmr1nb), jehož buněčná lokalizace může být řízena touto postranslační modifikací.
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Postranslation modifications affecting function of nuclear localization signal
Šebrle, Erik ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Venit, Tomáš (oponent)
Transport proteinů do jádra přes jadernou blánu je kontrolovaný převážně prostřednictvím jaderné lokalizační sekvence/signálu (NLS). Jaderný lokalizační signál je bohatý na pozitivně nabyté aminokyseliny arginin a lysin. Bylo zjištěno, že aktivita tohoto jaderného lokalizačního signálu může být regulována prostřednictvím fosforylace serinu v jeho těsné blízkosti. Fosforylace serinu nebo fosfomimetické změny těchto presekvencí (NLS) může představovat důležitý mechanismus regulující lokalizaci proteinu v buňkách v závislosti na jejich buněčné aktivaci. V naší laboratoři byl identifikován protein - Fragile X mental retardation syndrome 1 neighbor (Fmr1nb), jehož buněčná lokalizace může být řízena touto postranslační modifikací.
|
|
|
Studium post translačních modifikací fosducinu
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá studiem úlohy posttranslačních modifikací fosducinu na jeho interakci s proteinem 14-3-3 a dále posouzení vlivu tvorby komplexu na tyto modifikace. Fosducin je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také v jiných tkáních. Přes mnohé experimenty jsou však jeho fyziologické funkce stále řešeným tématem. Spekuluje se o jeho vlivu při regulaci signální dráhy oční sítnice, krevního tlaku a exprese G-proteinů. Funkce fosducinu je regulována proteinem 14-3-3, jenž hraje roli v mnohých biochemických procesech. Tvorba komplexu mezi proteinem 14-3-3 a fosducinem vyžaduje fosforylaci dvou serinových zbytků v N-terminální doméně molekuly fosducinu. Úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je ovšem stále nejasná. V rámci této diplomové práce byly exprimovány proteiny 14-3-3ζ∆C a fosducin (s mutací Q52K) a úspěšně purifikovány. Ke studiu vlivu tvorby komplexu na posttranslační modifikace fosducinu bylo využito limitované proteolýzy a defosforylace. Experimenty ukázaly, že tvorba komplexu způsobuje významné zpomalení defosforylace Ser-54 i Ser-73 a proteolytické degradace, což indikuje protektivní funkci vazby proteinu 14-3-3ζ∆C. Úloha obou 14-3-3ζ∆C vazebných motivů obsahujících Ser-54 a Ser-73 pro interakci fosducinu s...
|
|
|
Characterisation of the mechanisms regulating 53BP1 nuclear transport
Liďák, Tomáš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Protein 53BP1 se významně podílí na buněčné odpovědi na poškození DNA a udržování integrity genomu. Nedávno bylo popsáno, že je transportován do jádra prostřednictvím importinu ß. Cílem této práce bylo identifikovat jaderný lokalizační signál proteinu 53BP1, a to s využitím metod fluorescenční mikroskopie a imunoprecipitace. Získané výsledky ukázaly, že protein 53BP1 váže importin ß prostřednictvím svých dvou úseků bohatých na bazické aminokyseliny (1667-KRK-1669 a 1681-KRGRK- 1685). Tyto úseky byly rovněž nutné pro jeho vstup do jádra. Krátký polypeptid zahrnující tyto dva úseky vázal importin ß a umožnil transport GFP do jádra. Dále jsem se zaměřil na testování vlivu fosforylace serínu 1678 na transport proteinu 53BP1 do jádra. Mutanta 53BP1-S1678D, která mimikuje fosforylovaný serín na pozici 1678, měla výrazně sníženou schopnost vázat importin ß a byla hůře transportována do jádra. Nicméně žádné změny v transportu proteinu 53BP1 do jádra nebyly pozorovány, a tak se zdá, že fosforylace serínu 1678 cyklin-dependentními kinázami nebude významně regulovat jeho transport. Závěrem lze konstatovat, že protein 53BP1 má klasický bipartitní jaderný lokalizační signál. I když se transport proteinu 53BP1 do jádra nezdá být regulován v průběhu buněčného cyklu, může být regulován v odpovědi na jiné podněty....
|
|
|
Role Polo-like kináz v regulaci buněčného cyklu a odpovědi na poškození DNA
Kudláčková, Radmila ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Šolc, Petr (oponent)
Při každém buněčném dělení musí dojít k rovnoměrnému rozdělení genetického materiálu do obou dceřiných buněk. V další fázi se musí chybějící část genomu dosyntetizovat. Celý cyklus podléhá regulaci ze strany cyklin-dependentních kináz (Cdk) ve spolupráci s cykliny. Dojde-li v průběhu buněčného cyklu k poškození DNA, signální dráhy kontrolních bodů potlačí průběh cyklem a zajistí, aby se buňka nedělila, dokud nebude zjednána náprava. Pokud kontrolní body neplní svoji funkci, dochází k nádorovému bujení. Polo-like kinázy (Plk) jsou stejně jako Cdk důležitými regulátory buněčného cyklu. Plní řadu funkcí především v mitóze, ale i v odpovědi na DNA poškození. Tato práce je zaměřena zejména na lidské homology, nicméně konzervovanost homologů mezi organismy je značná, tudíž uvedené poznatky mají obecnější platnost. Lidské buňky exprimují pět proteinů z rodiny Polo-like kináz, z nichž Plk1 odpovídá Polo-like kinázám nižších eukaryot. Poznatky o ostatních čtyřech kinázách jsou teprve na vzestupu.
|
|
|
Vliv fosforylace na jaderný import virových proteinů a komplexů
Pokorná, Karolína ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Replikace celé řady virů probíhá v jádře hostitelské buňky. Tyto viry objevily způsob jak překonat překážku v podobě jaderného obalu a často doslova přimět buňku, aby zajistila jaderný import jejich proteinů a genomu. Pro mnoho virových proteinů je důležité, aby byl jejich transport do jádra přesně načasován. Díky tomu je zajištěn ideální průběh replikace viru, případně je umožněno, aby protein během životního cyklu viru plnil různé funkce v závislosti na své lokalizaci. Jedním ze způsobů regulace jaderného importu virových proteinu je jejich fosforylace. Fosforylace může jaderný import virových proteinů a komplexů kontrolovat různými způsoby. Například může ovlivnit afinitu virového proteinu k importinům nebo jiným buněčným proteinům, nebo také vyvolat změnu konformace proteinu, která vede k vystavení lokalizační sekvence.
|
host ::
RSS.