|
|
Peptidové inhibitory imobilizované na magnetické nosiče a Sepharosu aplikované na separaci žaludečních aspartátových proteinas
Rajčanová, Michaela ; Kučerová, Zdenka (vedoucí práce) ; Fusek, Martin (oponent) ; Pacáková, Věra (oponent)
v češtině Lidská žaludeční šťáva obsahuje hlavně aspartátové proteinasy: pepsin A a pepsin C. Oba pepsiny jsou produkovány v žaludeční sliznici jako inaktivní pepsinogeny a k jejich aktivaci na příslušné pepsiny dochází v kyselém prostředí žaludku. Hladiny pepsinogenů v krevním séru odrážejí morfologický a funkční stav žaludeční sliznice. Téma dizertační práce je součástí projektu zabývajícího se zejména vypracováním metody pro separaci žaludečních aspartátových proteinas, která by byla vhodná pro diagnostické účely. Konkrétním předmětem předkládané práce byla příprava nových typů ligandů, která by umožňovala po imobilizaci separaci aspartátových proteinas. Pro studium vazebných vlastností pepsinů byly syntetizovány čtyři heptapeptidy obsahující D-leucinylový zbytek (Val-D-Leu-Pro-Phe-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr- Tyr-Val-D-Leu a Val-D-Leu-Pro-Phe-Tyr-Val-D-Leu). Připravené heptapeptidy imobilizované na agarosové magnetické částice byly použity pro studium jejich interakcí s prasečím pepsinem A a potkaním pepsinem C. Zatímco prasečí pepsin A byl adsorbován na všechny heptapeptidy imobilizované na magnetické částice, potkaní pepsin C se na imobilizované heptapeptidy neadsorboval. Obdobné výsledky byly získány při afinitní chromatografii na heptapeptidech...
|
|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití různých metod izolace DNA baktérií mléčného kvašení v molekulárně biologických metodách
Chvalkovská, Eva ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předkládaná práce se zabývá probiotickými bakteriemi, izolací DNA z těchto baterií třemi různými metodami a vlivu izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. Probiotické bakterie jsou důležitou součástí trávícího traktu člověka. Mají důležitou roli pro funkci imunitního systému, a to díky adhezi na sliznici trávícího traktu, kde vytváří nehostinné prostředí pro patogeny. Probiotické baterie přijímáme běžně v potravě, ať už v mléčných výrobních nebo pomocí doplňků stravy. Díky nadužívání antibiotik ovšem hrozí riziko předání vnitřní rezistence, kterou probiotické bakterie mají kvůli udržení přirozené homeostáze trávícího traktu, patogenním bakteriím. Je tedy důležité efektivně identifikovat rizikové probiotické bakterie, které mají schopnost rezistenci přenášet a eliminovat tak jejich přítomnost v potravinách a potravinových doplňcích. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA, metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky. Přítomnost jednotlivých kmenů DNA v potravinových doplňcích byla potvrzena metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Jako nejlepší metoda izolace, co se týče čistoty a koncentrace izolované DNA byla na základě RT–PCR a spektrofotometrie vyhodnocena metoda izolace komerčním kitem.
|
|
|
Isolation and detection of DNA from plant species important for food prodution
Orel, Matúš ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
In the food industry, it is very important to take care of the quality, safety and organoleptic properties of the products supplied. For this reason, food must be checked. However, not all information can be found using conventional techniques such as immunoassays, chromatographic techniques, etc. DNA-based techniques can be used for these cases where traditional procedures are insufficient. Among them, the best known technique is PCR. The aim of the thesis was to isolate DNA from vegetable samples (broccoli, beetroot, carrot and pepper). DNA was isolated using the magnetic particle method and the traditional CTAB method. Both methods were able to isolate the DNA from the vegetable samples in quality and at a concentration suitable for PCR, where the 35S rDNA gene region was amplified (more precisely about 700 bp of the 18S-ITS1-5,8S region). After amplification, the PCR products were subjected to restriction reactions and the results compared to bioinformatic analysis. These steps have succeeded in finding suitable enzymes for diferentiation of PCR products from the tested vegetable species.
|
|
|
Fluorescenční detekce v analýze patogenů
Tomečková, Kristýna ; Kristýna, Zemánková (oponent) ; Bezděková, Jaroslava (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá izolací a detekcí bakterií a to pomocí metody zvané molekulový imprinting ve spojení s fluorescenční mikroskopií. Teoretická část práce se soustřeďuje na porovnání vyvinutémetody s dosud využívanými metodami. Praktická část byla zaměřena na přípravu a optimalizaci molekulově imprintovaných polymerů na dvou různých nosičích – multititrační destičce a magnetických částicích. Jako otiskovaný templát byla vybrána bakterie Enterococcusfaecalis a její kompetitor bakterie Staphylococcus aureus.
|
|
|
Tau protein, a biomarker of Alzheimer's disease: in vitro phosphorylation and tau-reactive antibodies characterization
Hromádková, Lenka ; Bílková, Zuzana (vedoucí práce) ; Fialová, Lenka (oponent) ; Krejsek, Jan (oponent)
Tau protein je s mikrotubuly asociovaný protein, který se nachází v axonech neuronů. Je klíčovou molekulou podílející se významně na patogenezi Alzheimerovy nemoci (AN), která je nejčastější příčinou stařecké demence. Tau patří do skupiny tzv. přirozeně nesbalených proteinů postrádajících globulární strukturu a vysoce náchylných k post-translačním modifikacím. Za patologických podmínek je tau protein abnormálně modifikován a chybně sbalován, což v důsledku vede k jeho oligomerizaci a agregaci do párově helikálních filament, které jsou základní jednotkou neurofibrilárních klubek, histopatologických útvarů typických pro AN. Současné léky používané v léčbě AN neurodegenerativní procesy pouze zpomalují a lék zcela zastavující vlastní rozvoj nemoci stále chybí. V současnosti je velmi slibným a rozvíjejícím se terapeutickým přístupem imunoterapie. Testována je také imunomodulace pomocí intravenózních imunoglobulinových preparátů (IVIG), které obsahují velké množství přirozených protilátek běžně se vyskytujících u zdravé populace. Objevení přirozeně se vyskytujících protilátek reaktivních s tau proteinem (nTau-Ab) v tělních tekutinách u pacientů s AD, zdravých kontrol, i jejich přítomnost v IVIG preparátech odstartovaly snahy lépe pochopit jejich úlohu u AN a jejich potenciální terapeutické využití....
|
|
|
Příprava vzorků pro analýzu DNA v potravinách rostlinného původu
Silná, Renata ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace vysoce kvalitní rostlinné DNA je nezbytná pro mnoho aplikací molekulární biologie. Nicméně, rostlinná DNA a potraviny rostlinného původu obsahují velké množství polysacharidů, polyfenolů a jiných sekundárních metabolitů, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA. Cílem této diplomové práce byla příprava vzorků a různých potravinových matric pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Jednalo se o 5 druhů zeleniny a 10 druhů různě zpracovaných zeleninových potravinových výrobků. Homogenizace matric byla provedena v CTAB pufru. Izolace rostlinné DNA byla provedena magnetickými částicemi s navázanými karboxylovými skupinami. Veškerá DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, testována dvěma sadami primerů umožňujících amplifikaci 700 bp amplikonů, u tepelně zpracovaných výrobků na 220 bp a pro PCR v reálném čase. Byla srovnána účinnost separace magnetických částic s navázanou DNA pomocí magnetického separátoru a magnetické jehly. DNA vyšší čistoty byla izolována magnetickou jehlou. Mikrometoda izolace rostlinné DNA z homogenátů s CTAB pomocí magnetických částic je vhodná pro různě zpracované potraviny.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
host ::
RSS.