|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Mrízová, Iveta
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorových léčiv v neuroblastomech
Groh, Tomáš ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Levová, Kateřina (oponent) ; Vališ, Karel (oponent)
Nádorové buňky se obvykle dokážou dynamicky adaptovat na stresové hypoxické prostředí, které je způsobené nedokonalou vaskularizací nádoru. V disertační práci bylo zjištěno, že neuroblastomové nádorové linie UKF-NB-3 a UKF-NB-4 se na hypoxii adaptují zvýšením acetylace histonů. Zvýšená acetylace je obecně spojována s rozvolněním chromatinové struktury, a tím i s transkripční aktivací genů. Dále bylo zjištěno, že hypoxie v těchto liniích mění expresi proteinu transkripčního faktoru N-myc, který je důležitý pro vývoj neuroblastomů. Zodpovědný je i za metabolickou adaptaci, zvýšenou agresivitu a horší prognózu onemocnění. Inhibitory histondeacetylas (HDAC) jsou slibné látky s protinádorovým účinkem. Mohou indukovat zástavu buněčného cyklu, diferenciaci či programovanou buněčnou smrt v sensitivních nádorech. V práci byl studován vliv inhibitoru HDAC, valproátu, na expresi proteinů transkripčních faktorů N-myc a faktoru 1α indukovaného hypoxií (HIF-1α), důležitých pro proliferaci nádorových buněk. Testovaný inhibitor HDAC způsoboval snížení exprese obou transkripčních faktorů, což potvrzuje jeho protinádorový efekt. Protein CD133 je spojován s fenotypem kmenových nádorových buněk. V disertační práci bylo zjištěno, že zvýšená exprese proteinu CD133 po kultivaci buněk UKF-NB-3 s valproátem je spojená s...
|
|
|
Nový voltametrický DNA biosenzor pro detekci poškození DNA onkologickými léčivy
Hrochová, Zuzana ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Tato bakalářská práce je zaměřena na optimalizaci podmínek pro použití jednoduchého voltametrického DNA biosenzoru, založeného na velkoplošné uhlíkové filmové elektrodě (ls- CFE), při detekci poškození DNA onkologickými léčivy. ls-CFE byla použita pro svoje výhodné vlastnosti, mezi které patří její rychlá příprava, jednoduchá mechanická obnova elektrodového povrchu, dobrá reprodukovatelnost výsledků, jednoduchá chemická modifikace a v neposlední řadě nízké výrobní náklady. Hlavním optimalizačním parametrem v této práci byl obsah ethanolu v roztoku, ve kterém byl biosenzor inkubován spolu s poškozující látkou. Byly testovány obsahy ethanolu v rozmezí 0 až 50 % (V/V) ethanolu v 0,1 mol/l fosfátovém pufru o pH 7,15 (PBS). Měření po inkubaci biosenzoru byla prováděna pomocí cyklické voltametrie (CV) za přítomnosti redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- v prostředí PBS. Jako optimální obsah ethanolu bylo zvoleno 5 %. Následně byl DNA biosenzor, jehož příprava byla již dříve optimalizována v předešlé bakalářské práci, využit při detekci poškození DNA modelovým cytostatikem - Elipticinem (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol). Pomocí techniky CV a redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- byla proměřena odezva biosenzoru na poškození DNA přímou interakcí s Elipticinem v závislosti na čase inkubace a koncentraci...
|
|
|
Metody stanovení rozpustnosti hydrofobních modelových karcinogenů ve vodném prostředí
Řeboun, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
2-Nitrobenzantrhron a 3-nitrobenzanthron jsou široce zastoupené polutanty v životním prostředí. Jejich zdrojem je automobilová doprava, ale i jiné spalovací procesy. 3- nitrobenzanthron je prokázaným mutagenem a karcinogenem v savčích i bakteriálních systémech. Po metabolické aktivaci tvoří adukty s purinovými bázemi v DNA. Zatímco příbuzný 2-NBA vykazuje o 3-4 řády nižší genotoxické působení. Jedním z cílů práce bylo stanovit rozpustnost 2-NBA, a také dalších dvou modelových karcinogenů - Sudanu I a ellipticinu ve vodném prostředí. Získané hodnoty porovnat mezi sebou a s již známou rozpustností 3-NBA. Rozpustnost by mohla být jedním z možných vysvětlení velmi nízkých genotoxických účinků 2-NBA oproti ostatním sledovaným látkám. Sudan I je běžné azobarvivo, které se běžně používá k barvení nejrůznějších látek, a je to prokázaný lidský karcinogen. Ellipticin, rostlinný alkaloid, je látka zajímavá zvláště díky svým protinádorovým účinkům, které pravděpodobně souvisí s její genotoxicitou. K dalším cílům patřilo stanovení rozpustnosti sledovaných látek v metanolu, získaní jejich extinkčních koeficientů a ověřit popřípadě vylepšit spektrofotometrické techniky, které byly použity pro tato stanovení. Ke stanovení byly použity dvě různé spektrofotometrické metody. Jedna byla založena na vymezení platnosti...
|
|
|
Rozpustnost modelových karcinogenů a její modulace v přítomnosti biomolekul
Řeboun, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
2-Nitrobenzanthron (2-NBA) a 3-nitrobenzanthron (3-NBA) jsou široce zastoupené polutanty v životním prostředí. Jejich zdrojem je automobilová doprava, ale i jiné spalovací procesy. 3-nitrobenzanthron je prokázaným mutagenem a karcinogenem v savčích i bakteriálních systémech. Po metabolické aktivaci tvoří adukty s purinovými bázemi v DNA. Zatímco příbuzný 2-NBA vykazuje o 3-4 řády nižší genotoxické působení. Jedním z cílů práce bylo stanovit rozpustnost 2-NBA, a také dalších dvou modelových karcinogenů - Sudanu I a ellipticinu ve vodném prostředí. Získané hodnoty porovnat mezi sebou a s již známou rozpustností 3-NBA. Rozpustnost by mohla být jedním z možných vysvětlení velmi nízkých genotoxických účinků 2-NBA oproti ostatním sledovaným látkám. Sudan I je azobarvivo, které se běžně používá k barvení nejrůznějších látek, a je to prokázaný lidský karcinogen. Ellipticin, rostlinný alkaloid, je látka zajímavá zvláště díky svým protinádorovým účinkům, které pravděpodobně souvisí s její genotoxicitou. Důležitým cílem bylo stanovit vliv albuminu, proteinu krevní plasmy na rozpustnost jednotlivých sledovaných látek. K dalším cílům patřilo stanovení rozpustnosti sledovaných látek v methanolu, získání jejich extinkčních koeficientů a ověřit, popřípadě vylepšit, spektrofotometrické techniky, které byly použity...
|
|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Modulace aktivit a exprese enzymů metabolisujících ellipticin inhibitorem histondeacetylas trichostatinem A
Kopejtková, Barbora
Inhibitor histondeacetylas trichrostatin A (TSA) zvyšuje toxicitu protinádorového léčiva ellipticinu vůči lidským neuroblastomovým buněčným liniím. Mechanismus tohoto působení však není znám. Jedním z možných mechanismů je rozvolnění struktury chromatinu, a tím zpřístupnění DNA pro modifikaci. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium dalšího z možných mechanismů vysvětlujícího tento dříve popsaný jev. Jedná se o odpověď na otázku, zda TSA neovlivňuje cytotoxicitu ellipticinu vůči neuroblastomům modulací aktivity a exprese cytochromů P450 a peroxidas. Tedy enzymů zodpovědných za míru cytotoxicity ellipticinu vůči nádorovým buňkám. Trichostatin A neovlivňuje oxidaci ellipticinu cytochromy P450 ve směru tvorby jak aktivačních, tak detoxikačních metabolitů tohoto protinádorového léčiva. Při oxidaci ellipticinu peroxidasami TSA zvyšuje tvorbu majoritního metabolitu ellipticinu, dimeru ellipticinu, který je metabolitem detoxikačním. TSA neovlivňuje aktivity CYP1A1, CYP1A2, CYP3A, které významně participují na oxidaci ellipticinu. Trichostatin A působí na expresi enzymů oxidujících ellipticin v neuroblastomových buněčných liniích. V kombinaci s ellipticinem v lidských neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-3 a UKF-NB-4 indukuje expresi CYP1A1 a CYP3A4 a naopak inhibuje expresi laktoperoxidasy.
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Studium expresního profilu neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 rezistentní na ellipticin
Pinkas, Michael ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Hinďoš Hřebačková, Jana (oponent)
Neuroblastom (NB) je maligní embryonální nádor periferního sympatického nervového systému odvozeného od neurální lišty a nejčastější nádor u dětí do jednoho roku života. Pokud je amplifikován protoonkogen MYCN u NB vysokého rizika, současná protinádorová terapie selhává zejména kvůli vzniku rezistence. Ellipticin (ELLI) je potenciální kancerostatikum, jehož cytotoxický účinek je založen především na inhibici topoisomerasy II, interkalaci do struktury dvojšroubovice DNA a tvorbě aduktů s DNA po enzymatické aktivaci cytochromy P450, peroxidasami, sulfotransferasami a N,O- acetyltransferasami. Dlouhodobá kultivace buněčné linie UKF-NB-4 s ellipticinem vedla ke vzniku rezistence, která je multifaktoriální. (i) Ukazuje se, že ELLI není z linie rezistentní na ELLI (UKF-NB-4ELLI ) vylučován jako doxorubicin při vzniku rezistence v UKF-NB-4, ale je transportován z jádra a sekvestrován v intracelulárních kompartmentech. Cytotoxicitu ELLI také snižuje (ii) nízké intracelulární pH v UKF-NB-4ELLI a (iii) snížená exprese topoisomerasy II. (iv) Exprese enzymů aktivujících ELLI zůstala nezměněná na úrovni mRNA detekované metodou "DNA microarray", pomocí qRT-PCR již však byla pozorována zvýšená exprese enzymů aktivujících ELLI cytochromu P450 3A4 a cyklooxygenasy-1. Navíc exprese cytochromu b5 se zvýšila, čímž se...
|
host ::
RSS.