|
|
Modifikace vnitřního povrchu kapilár pro elektroforetické separace liposomů
Píplová, Renata ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Čokrtová, Kateřina (oponent)
Elektroosmotický tok je jedním z hlavních faktorů, jež ovlivňují rozlišení separací v kapilární elektroforéze a často je nutná jeho modifikace. Jedním ze způsobů modifikace elektroosmotického toku je dynamické nebo permanentní pokrývání vnitřního povrchu kapiláry. Při separacích liposomů může taková modifikace navíc zmírnit jejich tendenci adsorbovat se na povrch kapiláry. Cílem práce bylo najít stabilní pokrytí, které bude dostatečně eliminovat elektroosmotický tok a otestovat jeho vliv na separace liposomů. Nejprve bylo testováno dynamické pokrytí kapiláry polymery Pluronic F-127, polyvinylpyrrolidon K30, polydialyldimethylamonium chlorid, polyethylenglykol a polyvinyalkohol pomocí čtyř různých metod pokrývání. Jednotlivé polymery a metody se lišily mírou potlačení elektroosmotického toku i stabilitou pokrytí. Z dynamických modifikací byla pro další testování separací liposomů zvolena pokrytí polymery Pluronic F-127, polyvinylpyrrolidon K30 a polydialyldimethylamonium chlorid. Liposomy s fluorescenční značkou byly separovány kapilární elektroforézou s laserem indukovanou fluorescenční detekcí a v jednotlivých pokrytích pak byla určena jejich mobilita. Nejvhodnější pro separace liposomů se jevilo pokrytí polymerem polyvinylpyrrolidon K30, ve kterém docházelo k nejmenším interakcím s liposomy v...
|
|
|
Srovnání detekčních technik pro analýzu sacharidů kapilární elektroforézou
Vlčková, Nikol ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Cílem této práce bylo porovnat detekční techniky kapilární elektroforézy pro stanovení sacharidů. Byly porovnávány bezkontaktní vodivostní detekce, přímá a nepřímá UV detekce a fluorescenční detekce. Sacharidy, které byly stanovovány byly glukóza, sacharóza a fruktóza. Měření s bezkontaktní vodivostní detekcí byla prováděna na kapiláře dlouhé 50 cm s vnitřním průměrem 20 µm. Napětí vložené na kapiláru bylo 15 kV a její teplota byla 25 řC. Jako základní elektrolyt byl použit 40mM NaOH. Kalibrační závislost byla měřena v koncentračním rozmezí 0,005 - 0,5 mg/ml. Opakovatelnost pro plochy píků a migrační časy a výtěžnost byly měřeny ve dvou koncentračních hladinách (0,02 a 0,2 mg/ml). Hodnoty RSD pro opakovatelnosti ploch píků a migračních časů se pohybovaly v rozmezí 0,01 - 8,64 %. Hodnoty pro limity detekce a kvantifikace se pohybovaly v rozmezí 1,0 - 5,8 µg/ml. Odchylky výtěžnosti od skutečné koncentrace analytů se pohybovaly mezi 7 - 22 %. Metody s UV nebo fluorescenční detekcí byly prováděny v kapilárách o vnitřním průměru 50 µm. Při metodě s nepřímou UV detekcí bylo napětí vložené na kapiláru 28 kV a její teplota byla 30 řC. Vlnová délka měření byla 207 nm a jako základní elektrolyt byl použit 50mM glycylglycin o pH 12,8. Kalibrační závislost byla měřena v koncentračním rozmezí 0,1 - 1 mg/ml....
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy v analýze suchých krevních skvrn
Ryšavá, Lenka ; Tůma,, Petr (oponent) ; Petr,, Jan (oponent) ; Kubáň, Pavel (vedoucí práce)
Krevní vzorky jsou standardně analyzovány ve formě plazmy nebo séra. Jako alternativa pro vzorkování a skladování krve se stále častěji uplatňují suché krevní skvrny (DBS). V předložené disertační práci jsou DBS zpracovány a analyzovány kapilární elektroforézou (CE), která byla v minulosti pro analýzu DBS využívána velmi zřídka. Nicméně CE nabízí mnohé výhody, dané vývojem této techniky v poslední době, kterými standardní analytické metody nedisponují. Přímé spojení CE s mikroextrakčními technikami a simultánní stanovení analytů přítomných v komplexních matricích vede k minimalizaci nebo eliminaci nedostatků DBS analýz jako jsou například vliv matrice, vliv hematokritu a nehomogenní distribuce analytů v DBS. V nejjednodušším možném uspořádání je dosaženo úpravy, dávkování a analýzy DBS vzorků výhradně komerční CE. Vývojem nových plně rozpustných vzorkovacích materiálů pro DBS je dosaženo lepších extrakčních vlastností a kvantitativních výsledků. Vyvinuté postupy zahrnují nové metody pro účinnou úpravu DBS vzorků a jejich přímou analýzu bez nutnosti zásahu operátora a dosahují dostatečnou selektivitu a citlivost pro stanovení významných analytů nejenom v DBS, ale i v dalších vzorcích se složitými matricemi.
|
|
|
Analytical approaches to study group interactions of azole pesticides with important biological active compounds
Kovač, Ishak ; Jaklová Dytrtová, Jana (vedoucí práce) ; Száková, Jiřina (oponent) ; Navrátil, Tomáš (oponent)
Cílem této disertační práce bylo vyvinout robustní analytickou techniku pro separaci a detekci reziduí triazolových fungicidů (TAF) a také studovat vliv TAF na rostlinu a biologicky aktivní látky. Je zde popsán vývoj metodiky pro stanovení reziduí TAF v reálných vzorcích (rajče "Sweet Cherry" - Solanum lycopersicum L.) pomocí kapilární elektroforézy. Vyvinutá metodika byla validována pro laboratorní použití pří relativně krátké době analýzy a nízkých nákladech na analýzu s dostatečnou mezí detekce a kvantifikace. Další část této disertační práce je zaměřena na vliv TAF na rajče jedlé, jeho růst, fruktifikaci a také vliv na biologicky aktivní látky. Kapilární elektroforéza je analytická technika, vyznačující se při minimální spotřebě vzorku (nL) obecně vysokou účinností při separaci malých molekul. V metodice je využito cyklodextrinem modifikované micelární elektrokinetické chromatografie k separaci směsi TAF získaných ze slupek rajčat. Optimální podmínky pro separaci byly nalezeny v elektrolytu tvořeného kyselinou fosforečnou a Tris (o koncentraci 100 mM), 20% v/v methanolem, se zdánlivým p[H+ ] 4,8. Složkami směsné micelární pseudostacionární fáze byly iontový deter- gent dodecylsulfát sodný (SDS) o koncentraci 15 mM a náhodně sulfátovaný gama- cyklodextrin (17,5 mg/mL). Metodické limity...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Analýza a charakterizace liposomů pomocí kapilární elektroforézy
Orgoníková, Andrea ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Coufal, Pavel (oponent)
3 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá analýzou tří různých typů liposomů pomocí kapilární elektroforézy s UV-VIS a laserem indukovanou fluorescenční detekcí a využitím liposomů jako pseudostacionární fáze pro separace analytů metodou liposomální elektrokinetické chromatografie. V rámci experimentů s liposomy DSPC-DSPG-PEG2000-DMPE s enkapsulovaným 5-fluoruracilem byl v elektroferogramech úspěšně identifikován pík liposomů s enkapsulovaným 5-fluoruracilem a pík volného 5-fluoruracilu. Oba píky vykazovaly shodné absorpční spektrum v UV oblasti, čímž byla potvrzena jejich identita. Bylo tedy ověřeno, že kapilární elektroforéza s UV-VIS detekcí je použitelná pro separaci a detekci volného a enkapsulovaného léčiva, což je nezbytné pro stanovení účinnosti enkapsulace. Sledováním změny efektivní mobility analytů po přídavku liposomů do základního elektrolytu byla hodnocena použitelnost zkoumaných liposomů v liposomální elektrokinetické chromatografii. Změna mobility byla pozorována u záporně nabitého 5-fluoruracilu a kladně nabitého tryptaminu a p-toluidinu. Absolutní hodnota efektivní mobility záporně nabitého 5-fluoruracilu se snížila vlivem interakcí s liposomy o 18,2 % a efektivní mobilita kladně nabitých analytů tryptaminu a p-toluidinu o 9,2 a 16 %. Prázdné liposomy DSPC-DSPG-PEG2000-DMPE-NBDPC s...
|
|
|
Elektroforetické stanovení oxidované a redukované formy glutathionu v rostlinném materiálu
Durychová, Eva ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Tato práce vychází z dříve publikované metody pro stanovení dvaceti proteinogenních aminokyselin pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí a zabývá se možností jejího využití ke stanovení oxidované (GSSG) a redukované (GSH) formy glutathionu s aminokyselinami. Teoretická část se nejdříve věnuje stručnému představení vlastností a významu glutathionu a jeho stabilizací vůči autooxidaci, konkrétně alkylací pomocí N-ethylmaleimidu (NEM) vázajícím se na GSH za vzniku alkylované formy (GSH-NEM). Dále se věnuje stručnému souhrnu dostupných metod k stanovení glutathionu, s detailnějším zaměřením na již vyvinuté metody kapilární zónové elektroforézy. Na závěr ve zkratce představuje elektroforetickou metodu pro stanovení dvaceti proteinogenních aminokyselin, ze které tato práce vychází. V praktické části se nachází postup, s jakým bylo zaváděno stanovení obou forem glutathionu do metody pro stanovení proteinogenních aminokyselin. Nejprve byla testována zjednodušená, časově méně náročná metoda v kratší 50,0 cm kapiláře bez hydroxyethylcelulózy, kde byly obě formy glutathionu separovány na základní linii během 10 minut. U této metody byly zjištěny relativní směrodatné odchylky ploch píků (GSH 2,1 %; 1,2 GSSG %; GSH-NEM 2,2%) a jejich migračních časů (GSH 0,56 %; GSSG 0,59 %; GSH-NEM 1,31...
|
|
|
Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí
Johaníková, Klára ; Bezděková,, Jaroslava (oponent) ; Pavelicová, Kristýna (vedoucí práce)
Diplomová práce s názvem „Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí“ je zaměřená na využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí pomocí elektromigračních metod a Försterova resonančního přenosu energie (FRET). Cílem této práce bylo vytvoření biokonjugátu proteinu metallothioneinu (MT) s kvantovými tečkami (QDs) a komerčními barvivy. Mezi těmito konjugáty byl následně studován FRET. QDs byly syntetizovány za působení UV záření a konjugace s MT byla provedena přes karbodiimidový zerolengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Díky vysokému podílu cysteinů v MT, má tento protein velmi vysokou afinitu ke kovům. Podílí se také na vychytávání volných radikálů a jsou i studie, které dokazují, že dochází ke zvýšené expresi MT v oblasti rakovinných buněk-nádorů. Pozornost byla věnována i studiu dimerizace MT, která vede k pochopení oxidativní dimerizace MT a tím může přispět k pochopení vzniku volných radikálů v těle a k prohloubení znalostí o neurodegenerativních poruchách jako je Parkinsnova nebo, Alzheimerova choroba či amyotrofická laterální skleróza. Vznik dimeru MT, byl potvrzen přenosem energie mezi donorem (QDs) a akceptorem (komerční barvivo-cyanin) skrze fyzikální jev FRET i pomocí MALDI-TOF-MS.
|
host ::
RSS.