|
| |
|
| |
|
|
Příprava reportérové buněčné linie pro ověření biologické aktivity rekombinantních proteinů
Kozojedová, Petra ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky patří mezi imunitní buňky zprostředkovávající nespecifickou imunitní odpověď organismu. Exprimují na svém povrchu řadu ligand-specifických aktivačních či inhibičních receptorů, mezi které patří přirozeně cytotoxický aktivační receptor NKp30, indukující po interakci s ligandem cytotoxickou odpověď. Receptor NKp30 má jednu ligand vazebnou imunoglobulinu podobnou extracelulární doménu s krátkou "stalk" doménou, která umožňuje oligomerizaci extracelulární domény receptoru NKp30, což vede k posílení interakce ligand- receptor a ovlivnění signalizace vedoucí k aktivaci buňky. Tato práce se zabývá přípravou konstruktů inspirovaných technologií chimerních antigenních receptorů nesoucích extracelulární doménu receptoru NKp30 se "stalk" doménou či pouze ligand vaznou doménu pro ověření biologické aktivity konstruktů po expresi na buněčné membráně. Byly připraveny dva vektory pro expresi konstruktů inspirovaných chimerními antigenními receptory s geny pro extracelulární doménu receptoru NKp30. Pro ověření biologické aktivity různých konstruktů byla plasmidová DNA kódující připravené konstrukty transientně transfekována do buněk Jurkat. Klíčová slova: NK buňky, NKp30, reportérová buněčná linie, rekombinantní protein, chimerní antigenní receptor
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Vliv bezlepkové diety na populace imunitních buněk na NOD myším modelu diabetu 1. typu
Tejklová, Tereza ; Funda, David (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Diabetes 1. typu (T1D) je autoimunitní onemocnění, které vede k destrukci inzulín produkujících β buněk v pankreatu. Faktory prostředí, jako např. expozice infekcím nebo složky diety, hrají podstatnou úlohu v etiopatogenezi T1D. V posledních desetiletích jsou navíc zodpovědné za prudký nárůst incidence T1D, a to především ve vyspělých zemích. Navzdory dlouhodobému výzkumu neexistuje kauzální léčba ani účinná prevence T1D. Zatímco účinky lepku jsou prozánětlivé, bezlepková dieta (gluten-free, GFD) byla dokumentována mnoha skupinami jako faktor prostředí, který výrazně snižuje incidenci T1D u spontánních zvířecích modelů T1D, především u NOD myší. Cílem této diplomové práce bylo lépe charakterizovat vlivy GFD diety na imunitní systém NOD myší. Pomocí průtokové cytometrie jsme studovali vliv standardní a GFD Altromin diety na populace NK buněk, regulačních a potenciálně regulačních T lymfocytů a jejich cytokinové profily u prediabetických SPF NOD samic, které byly vystaveny dietám již prenatálně. Vliv GFD na rozvoj diabetu jsme testovali adoptivním přenosem splenocytů, izolovaných z 12týdenních NOD myší, do NOD-SCID myšího modelu. Ověřili jsme diabetes protektivní efekt GFD u SPF NOD samic chovaných v našich podmínkách a na NOD-SCID modelu přenosu diabetu dokumentovali, že expozice GFD vede k nižší...
|
|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
NK buňky a KIR receptory: jejich význam v transplantacích hematopoetických kmenových buněk u leukemií
Ledvinková, Anna ; Vraná, Milena (vedoucí práce) ; Pačes, Jan (oponent)
NK buňky a KIR receptory: jejich význam v transplantacích hematopoetických kmenových buněk u leukemií Abstrakt Tato bakalářská práce pojednává o významu NK (natural killer) buněk u leukémií. Je zaměřena na strukturu a reaktivitu NK buněk, a především pak na transmembránové KIR receptory (killer cell immunoglobuline-like receptors) NK buněk, které hrají důležitou roli v likvidaci leukemických buněk (reakci štěpu proti leukemii, GvL) a tedy v celkové prognóze nemoci. Aktivační a inhibiční receptory KIR svou kooperací řídí cytotoxickou aktivitu NK buněk. Typizací genů pro KIR receptory u dárců hematopoetických kmenových buněk tak lze předpovědět úspěšnost léčby. Vyšetření genů KIR se využívá především u pacientů diagnostikovaných akutní myeloidní leukémií. Klíčová slova: KIR receptor, NK buňky, transplantace hematopoetických kmenových buněk, HSCT, leukémie, donor, recipient
|
|
| |
|
|
Příprava fúzních ligandů a ověření jejich vazby na NK buněčné receptory
Nepokojová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. natural killers - "přirození zabíječi") jsou důležitou součástí přirozené imunity. Na svém povrchu nesou komplexní skupinu receptorů, které používají různé signalizační motivy k aktivaci nebo k inhibici. NK buňky jsou schopny cíleně zabíjet aberantní buňky, tedy virové, infikované a nádorové buňky, pomocí speciálních cytotoxických mechanismů, kterými vyvolají apoptózu. Mezi aktivační receptory patří také receptory NKG2D, rozeznávající ligand MICA, a NKp30, který rozeznává ligand B7-H6. Pro imunitní systém člověka je tedy přirozené, že rakovinné buňky jsou ničeny pomocí NK buněk. Současné terapeutické cíle v léčbě nádorových onemocnění se zaměřují především na posilování vlastní přirozené schopnosti těla bojovat proti rakovině a je k tomu využíváno právě NK buněk. Vedle NK buněk jsou také nejen k léčbě rakoviny hojně využívány protilátky. Z velké části se jedná o monoklonální protilátky, avšak v současné době začínají být hojně využívané také fragmenty protilátek. Tato práce pojednává o přípravě tří bifunkčních fúzních proteinů: B7-H6-L-aHER2, MICA-L-aHER2 a aHER2-L-MICA, které obsahují imunoligandy aktivačních receptorů NK buněk a VHH fragment antiHER2 protilátky, v linii lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293T. Proteiny byly úspěšně připraveny a dále byla ověřena vazba na...
|
|
|
Vliv mutace S159A na oligomerní stav NKR-P1A receptoru lidských NK buněk
Hausleitner, Filip ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kožíšek, Milan (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (NK buňky) jsou lymfocyty schopné ničit nádorové a viry infikované buňky bez předešlé antigenní senzitizace. Využívají k tomu svoje aktivační a inhibiční povrchové receptory, které interagují s povrchovými molekulami cílových buněk. Imunitní odpověď NK buněk závisí na celkovém součtu signálů z obou typů receptorů. Receptor NKR-P1A lidských NK buněk patří do strukturní rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento receptor interaguje s jeho ligandem LLT1 ze stejné proteinové rodiny, přičemž tato interakce je charakterizována nízkou afinitou a vysokou specifitou. Vytvoření komplexu NKR-P1A:LLT1 mezi NK buňkou a cílovou buňkou inhibuje cytotoxicitu NK buňky, a tak je součástí regulace imunitní odpovědi. V této práci byl studován vliv mutace S159A na oligomerní stav rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A v roztoku. Pro tento účel byla úspěšně rekombinantně připravená mutantní forma rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A G90-S225 S159A ve stabilně transfekovaných lidských embryonálních ledvinných buňkách 293 (HEK293S GnTI" ). Připravený konstrukt byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a následně analyzován pomocí SDS-PAGE a sedimentační analýzy. Výsledky potvrzují, že absence N-vázané glykosylace v pozici 157 podporuje dimerizaci ektodomény v...
|
host ::
RSS.