|
|
Studium protein-proteinových interakcí v bakteriální pathogenesi: využití metodiky PIXL (photo-induced cross-linking)
Žídek, Radek ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Gramnegativní bakterie druhu Bordetella pertussis jsou původci smrtelného lidského onemocnění označovaného jako pertuse, častěji jako černý kašel. Tyto bakterie produkují adenylátcyklázový toxin (ACT), který se váže na povrch makrofágů a umožňuje vpravit do cytosolu hostitelské buňky přes cytoplazmatickou membránu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Abychom mohli studovat kovalentní interakce mezi proteiny pomocí fotochemického zesítění, byl náš studovaný protein exprimován s foto-methioninem (kyselinou L-2-amino-5,5- azi-hexanovou) v kultivačním médiu v bakteriálním kmenu Escherichia coli B834 (DE3). Foto- methionin je netoxickým analogem L-methioninu, takže je normálně inkorporován pomocí aminoacyl-tRNA syntház do struktury adenylátcyklázové domény. Maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury dAC bylo dosaženo po optimalizaci celého expresního protokolu. Celková míra inkorporace foto-methioninu do struktury proteinu po optimalizaci zjištěná hmotnostně-spektrometrickou analýzou byla až 80 %. Získaný protein s inkorporovaným foto- methioninem byl izolován. Byly provedeny síťovací experimenty s kalmodulinem a vláknitým hemaglutininem. Při těchto experimentech bylo provedeno jak fotochemické, tak i chemické zesítění. Vzniklé kovalentně zesítěné produkty byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a...
|
|
|
Exprese a purifikace fotoaktivované proteinové nanosondy pro studium klinicky relevantních protein-proteinových interakcí
Knížek, Antonín ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Koblihová, Jitka (oponent)
Cytochrom b5 je klíčovým proteinem pro funkci a regulaci savčí oxygenasy se smíšenou funkcí (MFO), která se nachází v endoplasmatickém retikulu. Proto je také relevantním cílem v klinicky zaměřených studiích. Abychom mohli studovat interakce cytochromu b5 pomocí kovalentního fotochemického zesítění, vytvořili jsme mutanty cytochromu b5 s methioninem v několika klíčových aminokyselinových pozicích v primární sekvenci proteinu, např. v pozici serinu 23 a leucinu 41. Přirozeně se vyskytující methioniny v cytochromu b5 (pozice 96, 126 a 131) byly zároveň mutovány na leucin bez vlivu na aktivitu cytochromu b5. Náš protein byl exprimován v auxotrofních bakteriích E. coli B834(DE3) s L-2-amino-5,5-azi- hexanovou kyselinou (foto-methioninem) přítomnou v kultivačním médiu. Tento methioninový analog s fotolabilním diazirinovým kruhem je aminoacyl-tRNA synthetasami běžně inkorporován do primární sekvence proteinu. Celý expresní protokol byl optimalizován tak, abychom dosáhli maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury cytochromu b5. Získaný exprimovaný protein byl izolován a míra inkorporace byla stanovena hmotnostně spektrometrickou analýzou pomocí MALDI-TOF. Dosáhli jsme až 93,4% inkorporace. Po rekonstituci se svými přirozenými interakčními partnery - cytochromem P450 2B4 (králičí isoforma) a...
|
|
|
Studium interakce PI4 kinasy IIalfa s VAMP3 proteinem
Dubánková, Anna ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Fosfoinositidy jsou nesmírně důležité pro regulaci aktivity mnoha signálních proteinů nejen buněčné membrány. Fosfatidylinositol - 4 - kinasy (PI4K) katalyzují tvorbu fosfatidylinositolu - 4 - fosfátu, molekuly s významnou regulační funkcí a prekurzoru řady fosfoinositidů. PI4K jsou svou patogenicitou spojovány s některými RNA viry, jako jsou Picornaviridae (poliovirus, coxsackie virus, aichi virus, enterovirus 71) a Flaviviridae (virus hepatitidy C). PI4K také hrají významnou roli při rozvoji rakoviny. Tato práce se snaží přispět k objasnění mechanismu regulace PI4 kinasy typu II α skrze její interakci s proteinem vesikulární membrány 3 (VAMP 3) z rodiny proteinů SNARE (z angl. "Soluble N-ethylmaleimide Sensitive Fusion Attachment Protein Receptor").
|
|
|
Aplikační potenciál modifikačních metod (chemická činidla, foto-nanosondy) a hmotnostní spektrometrie pro studium struktury proteinů a jejich vzájemných interakcí
Ptáčková, Renata ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Levová, Kateřina (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
K pochopení fyziologické funkce proteinů je nezbytná znalost jejich prostorového uspořádání, studium konformačních změn a vzájemných interakcí. Chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií představuje vhodnou doplňkovou techniku k běžným metodám strukturní biologie (RTG krystalografie, NMR spektroskopie), která umožňuje charakterizovat interakce v komplexech bílkovin za nativních podmínek. Předkládaná práce je zaměřena především na novou síťovací techniku založenou na in vivo inkorporaci analogu methioninu s foto-reaktivní funkční skupinou (foto-Met) do sekvence studovaného proteinu (tzv. proteinová foto-nanosonda). Interakce modelové dimerní molekuly proteinu 14-3-3zeta byla použita pro testování a optimalizaci přípravy proteinové foto-nanosondy a byla tak ověřena využitelnost této techniky k zachycení protein-proteinových interakcí. Byla řešena také interakce membránových hemoproteinů - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. S využitím chemického zesítění a MS analýzy byla charakterizována vzájemná interakce katalytických domén cytochromů a byly nalezeny dvě možné prostorové orientace cytochromů. Nově zavedená technika síťování pomocí foto-Met umožnila zachytit různé oligomerní stavy katalyticky aktivního membránového komplexu a byl stanoven molární poměr cytochromů v identifikovaných...
|
|
| |
|
|
Studium interakcí PI4 kinasy
Eisenreichová, Andrea ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent)
14-3-3 proteiny jsou důležitými regulačními bílkovinami, jež se nacházejí ve všech eukaryotních organismech, v lidských buňkách tvoří rodinu 14-3-3 proteinů sedm isoforem. Funkce 14-3-3 proteinů spočívá v interakci s jejich vazebnými partnery, jichž zatím bylo identifikováno několik set. Tito partneři mají klíčové role v mnoha buněčných pochodech, jako je signalizace, regulace buněčného cyklu a dělení, apoptosa a další. Tato bakalářská práce se zabývá studiem interakce 14-3-3 proteinu a fosfatidylinositol 4- kinasy IIIβ (PtdIns4KIIIβ) na molekulární úrovni metodou rentgenové krystalografie. PtdIns4KIIIβ nacházející se na cytosolové straně membrán převážně Golgiho aparátu katalyzuje připojení fosfátové skupiny na čtvrtý uhlík inositolového kruhu. Aktivita PtdIns4KIIIβ je závislá na fosforylaci serinu v pozici 294. Tato fosforylace nejen, že zvyšuje kinasovou aktivitu PtdIns4KIIIβ, ale také je podmínkou pro vazbu 14-3-3 proteinů. Tato interakce zajišťuje ochranu PtdIns4KIIIβ před defosforylací a tak zaručuje nepřetržitou syntézu fosfatidylinositol 4-fosfátu, významné signalizační molekuly a prekursoru pro další fosfátové deriváty fosfatidylinositolu.
|
|
|
Proteomická analýza vybraných onkohematologických onemocnění
Pimková, Kristýna ; Dyr, Jan (vedoucí práce) ; Kodíček, Milan (oponent) ; Petrák, Jiří (oponent)
Oxidační stres je významným faktorem v karcinogenezi onkohematologických onemocnění, ovšem jeho role v patogenezi myelodysplastického syndromu (MDS) nebyla doposud objasněna. V této práci jsme stanovili oxidační status v plazmě MDS pacientů a sledovali změny proteomu (oxidační modifikace proteinů, interakce a vznik komplexů), ke kterým v plazmě MDS pacientů v důsledku oxidačního stresu dochází. Pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie jsme stanovili hladiny celkového cysteinu, homocysteinu, cysteinylglycinu, glutathionu, dusitanů a dusičnanů v plazmě 61 MDS pacientů a 23 zdravých dárců. Oxidační stres u MDS pacientů prezentovaný signifikantně sníženými hladinami glutathionu a dusitanů a signifikantně zvýšenými hladinami ostatních aminothiolů nekoreloval s přetížením železem. Dále jsme naměřili zvýšené hladiny asymetrického dimethylargininu v séru pacientů středního věku s MDS, které souvisí s posttranslační modifikací arginylových zbytků proteinů. Nalezli jsme signifikantně zvýšenou hladinu karbonylovaných proteinů v plazmě MDS v porovnání se zdravými dárci. Pomocí hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali pět S-nitrosylovaných proteinů krevních destiček u MDS pacientů a navrhli jsme soubor šestnácti plazmatických proteinů, z nichž některé mohou být s velkou pravděpodobností karbonylované v...
|
|
|
Hmotnostní spektrometrie v proteomice: strukturní biologie a klinické aplikace
Pavlásková, Kateřina ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Hmotnostní spektrometrie (MS) je rychlá, specifická, citlivá a experimentálně variabilní metoda, kterou lze s úspěchem použít v celé řadě proteomických aplikací, např. při identifikaci a řešení primární struktury proteinů nebo pro studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí. Zavedení tzv. měkkých ionizačních technik na konci 80. let minulého století umožnil ionizovat bez nežádoucí fragmentace biologické makromolekuly jako jsou proteiny, oligosacharidy nebo nukleové kyseliny, a tak nejvíce ovlivnil využití hmotnostní spektrometrie na poli proteomiky. Cílem této práce bylo použití současných přístupů hmotnostní spektrometrie při řešení několika proteomických otázek. První část práce je zaměřena na studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí pomocí kombinace techniky chemického zesítění s MS analýzou ve třech modelových systémech: (1) homodimeru lidského regulačního proteinu 14-3-3, (2) systému proteinu 14-3-3 s regulační doménou tyrosinhydroxylasy, a (3) systému dvou membránových proteinů účastnících se biotransformace xenobiotik - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. Tento metodický přístup pracuje s proteiny ve vodných roztocích za fyziologických podmínek a zachovává tak jejich nativní struktury. Ve druhé části práce byly pomocí MS studovány proteinové profily...
|
|
|
Studium inkorporace modifikovaných aminokyselin do cytochromu b5
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pavlásková, Kateřina (oponent)
Cytochrom b5 (cyt b5) může ovlivňovat reakce katalyzované cytochromy P450, a v důsledku toho se může podílet i na aktivaci látek (například léčiv, karcinogenů) případně ovlivňovat poměry vzniklých metabolitů. Mechanismu působení cyt b5 ještě nebyl zcela objasněn. Přínosem k objasnění mechanismu by mohlo být zjištění protein-proteinových interakcí v monooxygenasovém systému, kterého je tento protein součástí. Pro studium těchto interakcí pomocí síťovacích technik je vhodné připravit fotolabilní cyt b5, který by se po fotoaktivaci stal vysoce reaktivním a vytvořil by komplex s nejbližšími složkami v monooxygenasovém systému.Tato práce se zabývá vypracováním metody pro produkci rekombinantního cyt b5 s modifikovanými aminokyselinami. Cyt b5 byl exprimován v bakteriálním kmeni E.coli BL-21 (DE3) Gold. Před indukcí exprese byly bakterie převedeny do limitního media (DMEM-LM), které neobsahovalo L-leucin a L-methionin. Limitní mediu bylo doplněno modelovou deuterovanou aminokyselinou d3-methyl-L-methioninem a D,L-leucinem. Exprimovaný cyt b5 byl izolován a inkorporace d3-methyl-methioninu byla ověřena hmotnostní spektrometrií. V úvodních experimentech byl cyt b5 získán převážně jako apoprotein (apo-cyt b5). Pro zvýšení inkorporace hemu do apo-cyt b5 byl studován vliv teploty na inkorporaci hemu při...
|
|
| |
host ::
RSS.