|
|
Využití vybraných fluorescenčních technik ke studiu kvasinek a jejich metabolitů
Mikheichyk, Nadzeya ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce byla optimalizace metod pro studium kvasinek a jejich metabolitů s využitím průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Červené kvasinky jsou charakteristické nadprodukcí karotenoidů a lipidů, které jsou využívané v potravinářském, farmaceutickém a krmivářském průmyslu. V současnosti se intenzivně zkoumají vhodné mikrobiologické alternativy pro produkci těchto látek. V této práci byly zkoumány vybrané kvasinkové rody: Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium a kmen Phaffia rhodozyma. Kvasinky byly kultivovány na různých živných médiích, kde byla jako nutriční zdroj použita glukóza a dále také na vybraných odpadních materiálech glycerolu a syrovátce. U dvou kmenů Cystofilobasidium macerans a Rhodotorula mucilaginosa byly stanoveny růstové charakteristiky na syntetickém glukózovém produkčním médiu. Všechny studované kmeny byly schopny využívat použité odpadní substráty jako zdroj živin. U části kmenů byla pozorována zvýšená produkce karotenoidů, a v některých případech byla doprovázena i relativně vysokou produkcí lipidů. U klasické kultivace nejlepší produkční vlastnosti projevil kmen Rhodotorula glutinis v lipidovém a v glukózovém médiu s přídavkem vitaminů. Na glycerolu nejvíce karotenoidů a lipidických látek produkoval kmen Sporobolomyces shibatanus. Kmen Sporobolomyces roseus projevil nejlepší produkční vlastnosti na syrovátce, jako hlavním zdroji uhlíku. Z výsledků vyplývá, že využití syrovátky a glycerolu se jeví jako vhodná varianta možného zdroje uhlíku ke kultivaci karotenogenních kvasinek a produkci karotenoidů a vybraných lipidických látek jakožto produktů s vyšší přidanou hodnotou. Bude ale nutné dále optimalizovat živné médium na daných substrátech pro větší produkci vybraných metabolitů. Fluorescenční mikroskopie a průtokový cytometrie se ukázaly jako vhodné varianty pro stanovení obsahu sledovaných metabolitů v buňkách, jejich množství a viability.
|
|
|
Srovnání metabolické aktivity a potenciálního využití mikrořas a pigmentotvorných kvasinek
Szotkowski, Martin ; Kočí, Radka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy jsou přírodními pigmenty vyskytujícími se v rostlinách a mnohých mikroorganismech, jako jsou řasy, kvasinky a bakterie. Představují nejrozšířenější skupinu antioxidantů s významným biologickým účinkem. Lipidy jsou esenciální složkou všech živých organismů. Jsou zdrojem a zásobárnou energie pro organismy, kterou lze využít také v petrochemickém průmyslu pro produkci biopaliv. Tato práce se zabývá studiem produkčních vlastností karotenoidů a lipidů vybranými kmeny kvasinek, řas a sinic, a to s cílem aplikace získaných poznatků a nalezení vhodné levné alternativy pro mikrobiální biotechnologickou produkci těchto metabolitů s využitím odpadních substrátů. Obsah karotenoidů, ergosterolu a koenzymu Q v buňkách byl stanovován kapalinovou chromatografií. Obsah lipidů a profil mastných kyselin byl analyzován plynovou chromatografií. Morfologie buněk a lokalizace vybraných metabolitů byla analyzována technikou časově rozlišené fluorescenční mikroskopie. V této práci byly využity kvasinkové rody Sporobolomyces, Cystofilobasidium a Rhodotorula. Z řas a sinic byl použity rody Desmodesmus, Cyanothece, Chlamydomonas, Synechoccocus a Chlorella. V celkovém porovnání produkčních vlastností, dosahovaly nejvyšší produkce kvasinky Z vybraných kmenů, bylo největších výtěžků karotenoidů dosaženo u kmenů S. pararoseus, C. capitatum a R. mucilaginosa a lipidů u kmenů C. infirmominiatum a S. metaroseus.
|
|
|
Optimalizace podmínek kultivace řasových kultur ve fotobioreaktorech
Byrtusová, Dana ; Márová, Ivana (oponent) ; Kočí, Radka (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce je zaměřena na optimalizaci kultivace kmenů Hameatococcus pluvialis ve fotobioreaktorech a biotechnologickou produkci astaxanthinu. V teoretické části byly shrnuty poznatky o podmínkách pro optimální růst a produkci sekundárních metabolitů. Dále byly charakterizovány aktuální kultivační systémy a možnosti monitoringu metabolitů a živin. V rámci experimentální části byla stanovena růstová charakteristika kmenu z Březové nad Svitavou HMP – CCALA 375 za optimálních podmínek na bílém a červeném světle. V průběhu růstu kultury byl studován také profil karotenoidů a jejich koncentrace. Vyšší výtěžek biomasy byl dosažen v kultivaci s bílým světlem (0,939 g/l). Z hlediska obsahu karotenoidů byly u obou kultivací dominujícími pigmenty lutein a -karoten. Další experimenty byly zaměřeny na stanovení optimálních růstových podmínek pro vybrané čtyři kmeny H. pluvialis z Německa, Ameriky, Afriky a Švýcarska. Jako nejvhodnější médium pro kultivaci bylo vyhodnoceno BBM, naopak nejhorší výsledky byly zaznamenány u BG11. Teplota kultivace 22°C byla v předchozích experimentech stanovena jako optimum pro srovnávací kmen HMP - CCALA 375. Vybrané čtyři kmeny byly podrobeny kultivaci nejen při 22°C, ale i při teplotě 25 °C. Kultivace při vyšší teplotě se ukázala být vhodná hlavně pro švýcarský, německý i africký kmen. Analýzou změny osvětlení bylo zjištěno, že je výhodnější kulturu předem adaptovat na nižší osvětlení (50 µmol fotonů•m^-2•s^-1) a poté zvýšit intenzitu na 100-150 µmol fotonů•m^-2•s^-1. Nejlepších růstových výsledků dosahoval švýcarský kmen, který by mohl být využitelný pro komerční produkci astaxanthinu. V poslední části práce byl zkoumán vliv stresových podmínek na produkci astaxanthinu kmenem z Březové nad Svitavou HMP – CCALA 375. Jako stresové faktory byly použity vysoké osvětlení (1 000 µmol fotonů•m^-2•s^-1), nízká koncentrace dusíku (32,96 mg/l), přídavek chloridu sodného (0,5%), vliv octanu sodného (2,2 mM) a kombinace chloridu a octanu sodného (0,5% NaCl, 2mM NaAc). Při vysokém osvětlení (1 000 µmol fotonů•m^-2•s^-1) bylo dosaženo největší akumulace astaxanthinu, která přesahovala 20 mg/g sušiny. Významný výtěžek byl pozorován i v kultivaci s přídavkem octanu sodného (9,2 mg/g) vzhledem k publikovaným hodnotám [103, 105]. Naopak minimální nárůst vykazovala kultura rostoucí v prostředí solného stresu (3,8 mg/g). V navazujících experimentech bude zkoumán vliv vhodných kombinací stresových faktorů nejen na kmen HMP – CCALA 375, ale i na jiné perspektivní kmeny H. pluvialis s cílem dosáhnout nadprodukce astaxanthinu významné pro velkoobjemovou kultivaci.
|
|
|
Produkce vybraných kvasinkových metabolitů využitelných do potravinových doplňků
Němcová, Andrea ; Čertík, Milan (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce pigmenty rastlín, ktoré sú tiež produkované mnohými baktériami a hubami. Predstavujú jednu z najviac rozšírených skupín prírodných antioxidantov s významnými biologickými účinkami a mnohými priemyselnými aplikáciami. V tomto smere je zvýšený záujem o karotenoidy ako prirodzené antioxidanty, ktoré majú mimo iné schopnosť znižovať prejavy chronických ochorení, patologických stavov u ľudí a celkovo spomaľujú proces stárnutia. Používajú sa prevažne v potravinárskom priemysle, ale hojne sú využívané aj v chemickom, farmaceutickom či kozmetickom priemysle. Jednou z možností získavania týchto látok je využívanie potenciálu červených kvasiniek, ktoré sú schopné prevádzať rôzne substráty v karoténové pigmenty. V predloženej práci boli testované kvasinky patriace do rodov Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium z hľadiska využívania vybraných odpadových substrátov. Boli tiež podrobené náhodnej mutagenéze za účelom zvýšenia produkcie biomasy a špecifických metabolitov – karotenoidov a iných lipidických látok. Ako alternatívne nutričné zdroje boli testované odpadové substráty z poľnohospodárskej a potravinárskej výroby (repka, ryža, pšeničné otruby, jablčná vláknina, cestoviny a lignocelulózové materiály). V niektorých produkčných médiách boli odpadové materiály hydrolyzované extracelulárnymi hydrolytickými enzýmami alebo komerčnými enzýmami za cieľom rozloženia komplexných sacharidických substrátov na jednoduché cukry utilizovateľné kvasinkami. Všetky testované kvasinkové kmene boli schopné využívať tieto odpadové materiály ako jediný zdroj uhlíka a zároveň produkovať pigmenty a obohatenú biomasu. V tejto práci bola študovaná charakterizácia karotenogénnych kvasiniek využitím molekulárnych techník. K tomuto účelu boli amplifikované medzidruhové konzervované sekvencie genómovej DNA, špeciálne oblasti rDNA D1/D2 ribozomálnej podjednotky a úseky ITS1 a 5,8-ITS2 rDNA. Tieto sekvencie boli podrobené analýze pomocou metódy DGGE k porovnaniu odlišností medzi jednotlivými karotenogénnymi kvasinkami. Technika izolácie intaktnej DNA bola optimalizovaná pre karyotypovú charakterizáciu kvasiniek metódou pulznej elektroforézy (PFGE). Jednotlivé karyotypy testovaných kvasiniek obsahovali viditeľné odlišnosti medzi kvasinkovými druhmi a rodmi.
|
|
|
Využití odpadních surovin k produkci obohacené kvasinkové biomasy
Starečková, Terezie ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; doc.PharmDr.Petr Babula, Ph.D. (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Kvasinky jsou stejně jako ostatní organismy neustále vystavovány vlivům okolního prostředí. Jejich přežití závisí na dovednosti přizpůsobit se environmentálním změnám včetně schopnosti využívat různé alternativní zdroje živin. V předložené disertační práci byly karotenogenní kvasinky patřící mezi rody Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium testovány z hlediska využitelnosti vybraných odpadních substrátů a rovněž podrobeny souběžně účinkům několika typů exogenního stresu a mutacím za účelem zvýšení produkce mikrobiální biomasy obohacené specifickými metabolity. Jako alternativní nutriční zdroje pocházející z odpadních substrátů ze zemědělské a hospodářské výroby byly testovány jablečné slupky, vláknina, kukuřičné klíčky a další. Kvasinky byly dále vystaveny působení osmotického, oxidačního a kombinovaného stresu (přídavky NaCl a H2O2 o různých koncentracích do kultivačních médií), dále iontů kovů selenu a chromu v koncentracích 0,01 mM, 0,1 mM a 1 mM. Testoval se také vliv mutagenu ethylesteru kyseliny metansulfonové. Při provedených experimentech se sledovala schopnost adaptace buněk, morfologické změny, zabarvení médií produkovanými pigmenty, tvorba některých významných kvasinkových metabolitů a změny ve fragmentaci chromozomální DNA. Za účelem vyhodnocení potenciálních změn v kvasinkovém genomu po působení mutagenu a stresových faktorů se optimalizovaly metody izolace intaktní chromozomální DNA a následná analýza pulsní gelovou elektroforézou. Množství produkovaných metabolitů se analyzovalo zejména pomocí RP-HPLC s UV/VIS a MS detekcí. V práci bylo prokázáno, že většina kmenů je schopna využívat studované odpadní substráty a produkovat na nich vybrané cílové metabolity. Biomasa se např. u R. aurantiaca na jablečné vláknině pohybovala kolem 7 g/l a u C. capitatum při kultivaci na neupravené syrovátce dosahovala 9 g/l. Vyprodukované množství karotenoidů činilo u R. aurantiaca při kultivacích na pšeničné kaši a kukuřičných klíčcích s enzymatickou hydrolýzou F. solani 1,01 mg/g, u S. roseus na těstovinách až 4,3 mg/g. Hodnoty syntézy ergosterolu se u R. aurantiaca pohybovaly na jablečných slupkách kolem 4,8 mg/g, u S. roseus při kultivaci na těstovinách s enzymatickou hydrolýzou P. chrysosporium 8,9 mg/g. Nejvhodnějším substrátem pro produkci biomasy a indukci karotenoidů jsou odpady obsahující směs jednodušších a složených sacharidů obohacená o přídavek dusíkatých látek. Potenciální cytotoxický účinek stresových faktorů o nízkých koncentracích nebyl prokázán. Genom karotenogenních kvasinek se podařilo rozdělit optimalizovanou metodou PFGE, karyotypy jednotlivých zástupců obsahují 11 a více chromosomů s viditelnými odlišnostmi mezi jednotlivými druhy i rody. V rámci zahraniční stáže se testovala schopnost rekombinantní kvasinky S. cerevisiae přeměňovat xylózu na xylitol, čímž by se dosáhlo zvýšení produkce bioethanolu jakožto náhradního zdroje paliv. Ukázalo se, že jak využitím ligninocelulózových materiálů k produkci biolihu, tak i různých odpadních substrátů k mikrobiální syntéze karotenoidů by vedlo ke snížení průmyslových výrobních nákladů na produkci kvasinkových metabolitů, jakož i ke snížení negativní zátěže na životní prostředí.
|
|
|
Molecular Study of Intracellular Changes as Response of Microorganisms to Environment
Čarnecká, Martina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
In nature yeast cells live in a rapidly changing environment. In order to survive constant fluctuations in their external surroundings cells quickly and effectively adapt their internal systems to meet the challenges of each new environment. One aspect of this cellular adaptation is the reorganization of genomic expression to the program required for growth in each environment. This genomic reorganization results in altered cell’s metabolome and physiology. The molecular responses elicited by the cells dictate whether the organism adapts, survives or, if injured beyond repair, undergoes death. In this work, genomic, proteomic and metabolic profiles of some carotenogenic yeasts grown in optimal and stress conditions were compared. To increase the yield of carotenoid pigments, several types of environmental changes as well as nutrition stress were applied. Yeasts were cultivated under osmotic, oxidative and metal stress, on different carbon sources or on various waste materials (whey, potato extract). Some chemical and UV mutants were also prepared and tested. Changes on yeast metabolome level were studied by RP-HPLC/MS technique used to carotenoid analysis. Another possibility to study stress response is preparation of transformed cells with deletion of definite genes. For setup, the method was first optimized for fission yeasts Schizosaccharomyces pombe. Technique is based on knockout constructs that contain regions homologous to the target gene cloned into vectors carrying dominant drug-resistance markers. As transformation vector plasmid pCloneKanmx confering resistance to geneticine was used. The vector and constructs were digested by relevant restriction endonucleases, ligated, amplified in E.coli and transformed into the yeast Schizosaccharomyces pombe sp286. Positive transformants were selected according to resistance to geneticine and checking PCR products. By analysis of transformants proteins required for meiotic chromosome segregation were identified.
|
|
|
Možnosti enkapsulace přírodních antioxidantů
Štindlová, Jitka ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce ve své teoretické části popisuje základní vlastnosti antioxidantů, především pak fenolických látek a anthokyanů, dále také přibližuje základní vlastnosti a principy vzniku volných radikálů. V teoretické části jsou také popsány různé způsoby enkapsulace antioxidantů do lipidických i polysacharidických částic. V experimentální části práce jsou popsány základní charakteristiky extraktů vybraných lyofilizovaných druhů ovoce a zeleniny – mrkve, jablek a směsi lesního ovoce. Jako skupinové parametry byly v extraktech stanovovány celková antioxidační aktivita, obsah polyfenolických a flavonoidních látek, anthokyanových a karotenoidních barviv a také obsah kyseliny askorbové. Dále jsou v experimentální části popisovány různé enkapsulační techniky, metody stanovení enkapsulační účinnosti jednotlivých postupů, stability a velikosti vzniklých částic. V práci bylo zjištěno, že ve většině zkoumaných vzorků i u většiny parametrů lze jako nejvýhodnější metodu enkapsulace z hlediska enkapsulační účinnosti vyhodnotit ethanolové vstřikování. Na druhou stranu jsou však částice připravené ethanolovým vstřikováním nejméně stabilní z hlediska zeta-potenciálu a z toho vyplývá jejich tendence vytvářet agregáty a shlukovat se. Naopak nejstabilnější se jeví částice připravené metodou odpařování na tenké vrstvě (TLE) a odpařování na tenké vrstvě s reverzními fázemi (RP-TLE). Částice připravené metodami TLE, RP-TLE a chitosan-alginátové částice měly záporný náboj, částice připravené ethanolovým vstřikováním měly náboj pohybující se kolem nuly a chitosanové částice měly kladný náboj.
|
|
|
Random mutagenesis and selection of red yeast mutants capable to utilize particular waste substrates
Čačková, Katarína ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids are naturally occurring pigments of plants also produced by microbes. The area of their application concerns mainly food industry; however, they are used in chemical, pharmaceutical, and cosmetics industry as well. Currently, the isolation of carotenoids from plants is markedly regulated by legislation, so the study of their production is greatly emphasised, where the microbiological, instead of the synthetic, production of carotenoids is being prioritized. This work was made as a comparative study of carotenogenic yeasts of the genes Rhodotorula, Sporobolomyces, and Cystofilobasidium. Their ability to use various waste substrates as a carbon and nitrogen source and source of other nutrition factors was tested. In this work, conditions of random mutagenesis were optimized. Particular yeast strains were also subjected to the effect of mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) in order to increase the production of biomass and specific metabolites – carotenoids and other lipid-soluble substances. Random mutagenesis and mutant strain selection was performed using waste subtrates as glycerol, pasta and some pasta hydrolyzed by fungal extracellular enzymes. Subsequently, a control of specific DNA sequences in pigments overproducing mutants was analyzed by PCR/DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis). Increased production of -carotene was achieved in a mutant of Sporobolomyces roseus strain growing on glycerol, pasta, and hydrolyzed pasta. Overproduction of carotenoids by mutant strain of Rhodotorula glutinis was observed in glucose medium only. Mutants of Cystofilobasidium capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Fusarium solani. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of the negative effects of wastes on the environment.
|
|
|
Microbial production of carotenoid pigments using waste substrates
Němcová, Andrea ; Ing.Martina Čarnecká, Ph.D. (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids are naturally occurring pigments produced by bacteria, yeasts, filamentous fungi and plants. They exhibit significant biological effects and are widely used in the food industry, pharmacy and cosmetics. The aim of this diploma thesis proposed as a comparative study was regulation of carotenoid and ergosterol production in red yeasts using several waste substrates as whey, corn germs, wheat, apple fiber and pasta. To selected production media extracellular hydrolytic enzymes degrading polysaccharide were added. These enzymes were obtained from the cultivation media of four fungal strains. In this study three carotenogenic yeast strains were used: Rhodotorula glutinis, Sporobolomyces roseus and Cystofilobasidium capitatum. All strains were cultivated simultaneously and changes in biomass and carotenoid production in different production media were monitored and compared. As the best waste substrate apple fiber was utilized, particularly in Rhodotorula glutinis, which exhibited mainly biomass production increase. In Sporobolomyces roseus increased production of biomass and carotenoids have been reported in media with hydrolyzed fiber and pasta as well. Beta-carotene production in this strain reached 4776,38 mg/g of dry weight. The strain Cystofilobasidium capitatum exhibited in waste media a decerase of biomass production accompanied with increased production of carotenoids, especially in wheat mush and pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Aureobasidium pullulan. It can be concluded that hydrolyzed waste substrates are very hopeful as cheap nutrient sources for yeast strains producing carotenoids and ergosterol. Nevertheless, further study of substrate processing for individual strains is needed.
|
|
|
Produkce karotenoidů kvasinkami rodu Cystofilobasidium
Vavrysová, Alena ; Kočí, Radka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy jsou významné průmyslové pigmenty přítomné prakticky ve všech živých organismech. Cílem předložené práce bylo studium regulace produkce karotenoidních pigmentů kvasinkami rodu Cystofilobasidium s využitím exogenních stresových faktorů. Růstová křivka kvasinky C. capitatum vykazuje podobně jako ostatní karotenogenní kvasinky dvoustupňový průběh s prodlouženou stacionární fází a s maximem produkce biomasy i beta-karotenu ve 103. hodině. Aplikované stresové faktory (2-5% NACl, 2-5 mM peroxid, 0,01 - 1 mM Se (IV), 0,1-5 mM Cr(III)) neměly významný vliv na tvorbu biomasy, která dosahovala průměrně 8-9 g/l. Výrazně pozitivní efekt vykazoval 5mM Cr, v jehož přítomnosti množství biomasy dosáhlo hodnoty 10 g/L. Tvorbu -karotenu pozitivně ovlivňovala řada aplikovaných stresových faktorů, nejvyšší výtěžek (695 g/g) byl dosažen v přítomnosti 0,1 mM Se. Tvorba ergosterolu nebyla regulována souběžně s karotenoidy jako u jiných karotenogenních kmenů. Produkční vlastnosti kvasinky C. capitatum za stresových podmínek byly srovnány s produkcí biomasy a pigmentů u kvasinek rodů Rhodotorula a Sporobolomyces. Kvasinka C. capitatum produkuje srovnatelné množství biomasy jako kvasinky rodu Rhodotorula v přítomnosti NaCl. Produkce -karotenu vykazovala vyšší hodnoty (502 g -karotenu/g) než kvasinky rodu Rhodotorula, avšak nižší hodnoty než zástupci rodu Sporobolomyces, u nichž však byla podstatně nižší produkce biomasy. Karyotyp kvasinky Cystofilobasidium se poměrně značně liší od karyotypů kvasinek rodů Rhodotorula i Sporobolomyces. Ze souhrnu dosavadních výsledků vyplývá, že kvasinka Cystofilobasidium capitatum vykazuje podobné fyziologické i produkční vlastnosti jako průmyslové kvasinky rodu Rhodotorula. I přes určité odlišnosti lze tyto kvasinky považovat za potenciální průmyslově využitelné kmeny k produkci karotenoidních pigmentů i biomasy obohacené karotenoidy a přídavkem biogenních prvků.
|
host ::
RSS.