|
|
Studium interakce receptoru NKp46 s adhesinem Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Jednou ze složek nespecifického imunitního dohledu organismu jsou NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky). Úkolem NK buněk je vyvolat apoptosu u cílových buněk (například buněk rakovinných či virově infikovaných). Cílové buňky jsou rozpoznávány pomocí povrchových receptorů. NK buňky mají na svém povrchu aktivační a inhibiční receptory. Mezi aktivační receptory patří receptor přirozené cytotoxicity NKp46. Jedním z několika dosud popsaných ligandů tohoto receptoru je adhesin Epa1 (z angl. epithelial adhesin 1) kvasinky Candida glabrata. Neschopnost těla spustit imunitní odpověď a bránit se kvasinkové infekci způsobuje vážné komplikace u pacientů s hematologickým onemocněním, tzv. invazivní kandidózy. NK buňky se začínají využívat také v rámci imunoterapie nádorů, konkrétně bispecifické fúzní proteiny, které se jednou částí váží na receptor NK buňky a druhou částí na nádorový antigen. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantního proteinu NKp46. Pro studium vlivu O-glykosylace na vazbu ligandu byl připraven mutant glykosylačního místa NKp46 T225A. Proteiny byly produkovány stabilně transfekovanými liniemi HEK293S GnTI- a HEK293T. Protein Epa1 byl produkován v expresním systému E. coli a poté purifikován. Schopnost vazby proteinu Epa1 a laktosy byla ověřena pomocí dvou...
|
|
|
Příprava fúzních domén lidských imunoreceptorů pro jejich využití v imunoterapii
Cmunt, Denis ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Jednou z funkcí imunitního systému je imunitní dohled nad nádorově transformovanými buňkami, tedy schopnost takové buňky odstranit dříve, než se mohou stát škodlivými pro organismus. V případě, že se transformovaným buňkám podaří imunitnímu dohledu uniknout, dochází k rozvoji onkologického onemocnění. Nádorová imunoterapie spočívá v cílené stimulaci imunitního systému v boji proti nádoru. V poslední době se projevuje zájem o využití NK buněk v imunoterapii nádorů. Tyto buňky, patřící k nespecifické imunitě, se podílejí na imunitním dohledu. Při setkání s cílovou buňkou rozhoduje o aktivaci NK buňky integrace signálu z jejích povrchových aktivačních a inhibičních receptorů, které vážou ligandy na povrchu cílové buňky. V případě, že dojde k aktivaci NK buňky, spouští proti cílové buňce cytotoxickou odpověď. Využití NK buněk v imunoterapii zahrnuje mimo jiné testování bispecifických fúzních proteinů, které mohou jednou částí vázat povrchový nádorový antigen a druhou částí NK buněčný aktivační receptor, čímž zprostředkují kontakt obou buněk a vyvolají cytotoxickou odpověď. Tato práce představuje přípravu bispecifických fúzních proteinů sestávajících z aktivačního ligandu MICA (pro receptor NKG2D), nebo B7H6 (pro receptor NKp30) a nanoprotilátky cílící jeden ze tří nádorových antigenů HER2, CD20 a FGFR....
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Strukturní biologie receptoru NKp44 a jeho ligandu PCNA
Herynek, Štěpán ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Součástí imunitního systému nejen člověka jsou tzv. NK buňky (z anglického natural killer cells). Úkolem těchto buněk, které jsou složkou nespecifické imunity, je vyvolat apoptózu u buněk tělu vlastních, které jsou hrozbou pro organismus (například buňky napadené viry či rakovinné buňky). K rozpoznání cílových buněk slouží NK buňkám povrchové receptory. Receptorů je dnes známa celá řada a jejich dělení vyplývá například z podobnosti jejich struktur, nebo povahy signálu, který zprostředkovávají NK buňkám. Podle toho rozlišujeme receptory aktivační a inhibiční. Inhibiční receptory potlačují NK buněčnou odpověď, zatímco receptory aktivační tuto odpověď vyvolávají. Během kontaktu NK buňky s jinou buňkou je výsledné chování NK buňky vždy výsledkem určité rovnováhy odpovědí receptorů aktivačních i inhibičních. Receptor NKp44 je imunoglobulinový receptor. Tento receptor je mezi ostatními receptory velmi ojedinělý z mnoha hledisek, například i proto, že je spojen jak s aktivačním, tak inhibičním motivem. Ligandem tohoto receptoru je jaderný antigen proliferujících buněk (PCNA). PCNA je svorkový protein důležitý mimo jiné během replikace DNA, při které ukotvuje ostatní proteiny replizómu. Tato práce je zaměřena na rekombinantní přípravu receptoru NKp44 (protein PCNA byl již připraven dříve) a studium...
|
|
|
Příprava fúzních ligandů a ověření jejich vazby na NK buněčné receptory
Nepokojová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. natural killers - "přirození zabíječi") jsou důležitou součástí přirozené imunity. Na svém povrchu nesou komplexní skupinu receptorů, které používají různé signalizační motivy k aktivaci nebo k inhibici. NK buňky jsou schopny cíleně zabíjet aberantní buňky, tedy virové, infikované a nádorové buňky, pomocí speciálních cytotoxických mechanismů, kterými vyvolají apoptózu. Mezi aktivační receptory patří také receptory NKG2D, rozeznávající ligand MICA, a NKp30, který rozeznává ligand B7-H6. Pro imunitní systém člověka je tedy přirozené, že rakovinné buňky jsou ničeny pomocí NK buněk. Současné terapeutické cíle v léčbě nádorových onemocnění se zaměřují především na posilování vlastní přirozené schopnosti těla bojovat proti rakovině a je k tomu využíváno právě NK buněk. Vedle NK buněk jsou také nejen k léčbě rakoviny hojně využívány protilátky. Z velké části se jedná o monoklonální protilátky, avšak v současné době začínají být hojně využívané také fragmenty protilátek. Tato práce pojednává o přípravě tří bifunkčních fúzních proteinů: B7-H6-L-aHER2, MICA-L-aHER2 a aHER2-L-MICA, které obsahují imunoligandy aktivačních receptorů NK buněk a VHH fragment antiHER2 protilátky, v linii lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293T. Proteiny byly úspěšně připraveny a dále byla ověřena vazba na...
|
|
|
Příprava receptoru AICL ve fúzi s Fc fragmentem lidského IgG
Runová, Alžbeta ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. "natural killer cells", přirozeně zabíječské buňky) jsou jedním ze základních prvků vrozené imunity. Hrají klíčovou roli v obraně proti virem infikovaným, nádorovým nebo jinak stresovaným buňkám. NK buňky mají na svém povrchu aktivační receptory spouštějící cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze cílové buňky a inhibiční receptory zajišťující buněčnou toleranci. Rovnováha signálů NK buněčných receptorů určuje výslednou reakci NK buňky s cílovou buňkou. Mezi receptory podobné lektinům typu C patří aktivační receptor NKp80 a jeho ligand AICL. AICL je myeloidně specifický aktivační receptor exprimovaný na nádorových buňkách. Komplex NKp80:AICL podporující cytolýzu maligních myeloidních buněk je studován v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Tato bakalářská práce popisuje přípravu vektorů obsahujících geny kódující expresní kostrukty AICL a následnou produkci proteinů v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK293S GnTI- ). Expresní konstrukty obsahují část extracelulární domény AICL, zásahové místo pro TEV proteasu a Fc fragment. Byly připraveny dva různé konstrukty - jeden obsahující nativní sekvenci AICL a druhý mutaci C87S.
|
|
|
Rekombinantní exprese proteinu NKp46 a jeho ligandu Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells - "přirozené zabijácké" buňky) jsou buňky nespecifické imunity a hrají důležitou roli v imunitní odpovědi organismu. Tyto buňky jsou schopny spouštět cytotoxické mechanismy při kontaktu s infikovanými, stresovanými či nádorovými buňkami. Spuštění mechanismů závisí na přítomnosti aktivačních a inhibičních ligandů na povrchu buněk. Na povrchu NK buněk jsou aktivační a inhibiční receptory, které po vazbě na příslušné ligandy vysílají signál NK buňce. Jeden z aktivačních receptorů NK buněk je NKp46. Jedná se o receptor ze skupiny NCR (z angl. natural cytotoxicity receptor - receptory přirozené cytotoxicity). Tento receptor má mnoho ligandů a jedním z nich je adhesin Epa1 z kvasinky Candida glabrata. Tato práce se zaměřuje na přípravu plasmidů a produkci extracelulární části receptoru NK buněk NKp46 a jeho ligandu adhesinu Epa1. Interakce receptoru a jeho ligandu bude zkoumána později. Plasmidy obsahující geny NKp46 a Epa1 byly úspěšně připraveny a ověřeny DNA sekvenací. Protein NKp46 byl produkován v eukaryotickém expresním systému buněčné linie HEK293S GnTI- . Byla připravena stabilně transfekovaná linie HEK293S GnTI- buněk a protein NKp46 byl následně extracelulárně sekretován a izolován z kultivačního média pomocí chelatační afinitní chromatografie a následně...
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Příprava lidského NK buněčného aktivačního receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) hrají klíčovou roli při rozpoznávání a ničení nádorových, infikovaných nebo jinak pozměněných buněk. Na svém povrchu nemají antigenně specifické receptory, proto je řadíme mezi složky přirozené imunity. K rozpoznání cílových buněk slouží řada jiných povrchových receptorů. Inhibiční receptory zajišťují buněčnou toleranci, naopak aktivační receptory spouští cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze a tedy lýzi buňky. Díky této vlastnosti jsou NK buňky intenzivně studovány v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Jedním z aktivačních receptorů je NKp80 rozpoznávající svůj ligand AICL. Oba proteiny patří do rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento komplex se účastní nejenom přímé lýze maligních buněk myeloidního charakteru, ale má také důležitou roli v imunomodulaci zánětu. Předmětem této diplomové práce je příprava receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL. Receptor NKp80 byl připraven v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK 293S GnTI- ). Byly připraveny stabilně transfekované linie produkující protein NKp80 konstitutivně nebo indukovatelně. Zapojení disulfidických můstků a obsazení N-glykosylačních míst proteinu NKp80 bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Dále byl optimalizován postup Mgr. Jiřího Nového na...
|
|
|
Study of NKp30 oligomerization and its interaction with B7-H6
Pažický, Samuel ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
NK buňky jsou důležitou součástí imunitního systému. Jsou schopné rozeznat a zničit nádorové buňky a buňky infikované virem. Pro rozpoznání jejich cílových buněk hrají důležitou roli jejich aktivační receptory. Aktivační receptor NKp30, protein z rodiny přirozeně cytotoxických receptorů, váže několik ligandů přítomných na povrchu nádorových buněk anebo tvořících části některých virů. B7-H6 je jedním z ligandů NKp30 a díky jeho specifické konstitutivní expresi na povrchu některých nádorů a nádorových buněk je zajímavým biologickým cílem. Ačkoli již byla struktura komplexu NKp30/B7-H6 vyřešena, strukturní podstata některých důležitých vlastností vazby komplexu zatím nebyla vysvětlena. NKp30 tvoří oligomery, jejichž přítomnost je ovlivněna délkou C-konce NKp30 a jeho N-glykosylací, avšak strukturní podstata a ani význam těchto oligomerů nejsou známy. Navíc je vazebná afinita NKp30 k jeho ligandům ovlivněna přítomností jeho glykosylace a také jejím typem. V naší laboratoři jsme již dříve zjistili, že oligomerizace NKp30 je závislá na jeho glykosylaci. V mé práci jsem se pokusil získat detailnější funkční a strukturní informace o oligomerizaci NKp30 a vazbě B7-H6 multimetodickým přístupem včetně rentgenové krystalografie. Zodpovězení vznesených otázek by nejen přispělo k základnímu výzkumu aktivačních...
|
host ::
RSS.