|
Regulace transkripce mikroRNA klastru miR-17-92 v průběhu diferenciace makrofágů.
Rybářová, Jana ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
miR-17-92 klastr (Oncomir1) kóduje sedm mikroRNA (miRNA, miR) regulujících řadu biologických procesů jako je proliferace, diferenciace nebo apoptóza. Zvýšená exprese mikroRNA kódovaných tímto klastrem byla zjištěna u řady nádorových onemocnění včetně akutní a chronické myeloidní leukémie (Dixon-McIver et al., 2008; Li et al., 2008; Venturini et al., 2007). Myeloidní progenitory významně exprimují miR-17-92 klastr, zatímco makrofágová diferenciace je doprovázena výrazným snížením jeho exprese. V naší laboratoři bylo prokázáno, že miR-17-92 klastr je během diferenciace primárních PUER myeloidních progenitorů indukovaných transkripčním faktorem PU.1 (SPI1) reprimován transkripčním faktorem Early growth response 2 (Egr2). Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucích fragmenty miR-17-92 putativního promotoru, které by umožnily studium regulace transkripce miR-17-92 klastru. Výsledně se podařilo připravit 8 fragmentů obsahujících různé úseky regulační oblasti miR-17-92 klastru v rozsahu -3.3 až 0 kb vzhledem ke kódující oblasti miR-17-5p, a to i přes vysoký CG obsah (~80%), které byly následně vklonovány do pGL3 reporterového vektoru. Transfekce a následná funkční esej pGL3 reporterového vektoru nesoucího -3.3;-0kb fragment putativního promotoru miR-17-92 v buňkách...
|
|
Infekce makrofágové linie J774.2 bakterií Francisella tularensis - změny membránových a nitrobuněčných molekul
Novosad, Jakub ; Krčmová, Irena (vedoucí práce) ; Raška, Milan (oponent) ; Kročová, Zuzana (oponent)
Souhrn: Úvod: Francisella tularensis (F.t.) je fakultativně intracelulárně rostoucí, gram negativní bakterie, způsobující onemocnění tularémie. Díky svým ojedinělým biologickým vlastnostem byla Centrem pro kontrolu chorob (CDC) v USA zařazena v souvislosti s nebezpečím jejího zneužití při vývoji biologických zbraní a bioterorismu mezi vysoce rizikové infekční agens (kategorie A). I přes intenzivní výzkum na poli imunobiologie infekce F.t. zůstává stále mnoho nezodpovězených otázek. Naše práce byla zaměřena na analýzu povrchové exprese molekul CD54, CD86 a CD16/32 a produkce oxidu dusnatého (NO) myší monocyto-makrofágovou linií J774.2 v průběhu primární infekce F.t. kmenem LVS in vitro a při předchozí či následné stimulaci lipopolysacharidem (LPS) a/nebo interferonem gama (IFNγ). Metodika: Exprese povrchových molekul byla měřena pomocí průtokového cytometru 3, 6, 9, 12 a 24 hodin po zahájení infekce a stimulace a byla hodnocena absolutní hodnota průměrné fluorescence (MFI) a její změny v čase (∆MFI). Produkce NO v buněčném supernatantu byla analyzována Griessovou metodou, ve stejných časových intervalech. Myší monocyto-makrofágová linie J774.2 byla kultivována v kultivačních lahvích v přítomnosti média Dulbecco's MEM s obsahem glutamátu a 10% fetálního bovinního séra (FBS) (2x106 buněk/10ml média). Buňky...
|
|
Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular Mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery
Kamanová, Jana
Název disertační práce: Adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis: molekulární mechanismus působení a jeho využití jako nosiče antigenů Autor: Jana Kamanová Souhrn První část této dizertační práce se věnuje molekulárnímu mechanismu působení adenylát-cyklázového toxinu (CyaA). Tento protein z rodiny RTX toxinů je sekretovaný gramnegativní bakterií Bordetella pertussis, která způsobuje infekční onemocnění nazývané černý kašel. CyaA hraje klíčovou roli ve schopnosti tohoto patogena kolonizovat sliznice horních cest dýchacích a to díky schopnosti potlačovat baktericidní funkce myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému hostitele. CyaA se váže na integrin CD11b/CD18 (označovaný také jako CR3 nebo αMβ2) těchto buněk, vytváří v jejich buněčných membránách malé kation-selektivní kanály, a dopravuje do jejich cytozolu N-koncovou adenylát- cyklázovou (AC) doménu. Ta je po svém průniku do buněčného cytozolu aktivována navázáním eukaryotického kalmodulinu a katalyzuje velmi efektivní přeměnu ATP na cAMP, jednu z klíčových molekul buněčné signalizace. Tím dochází v napadených buňkách k nárůstu hladiny cAMP, což vyvolá rychlou ztrátu schopností fagocytózy pomocí Fc-receptorů a oxidativního vzplanutí těchto buněk. CyaA má unikátní schopnost přenášet svou AC doménu do cytozolu buněk přímo z...
|
|
ANCA-Associated Vasculitides : Complex Diagnostic Approach
Hrušková, Zdenka ; Posová, Helena (vedoucí práce) ; Stříž, Ilja (oponent) ; Žák, Aleš (oponent)
Cíle práce: Cílem této práce bylo zhodnotit parametry buněčné imunity u pacientů s ANCA (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Autoantibodies - autoprotilátky proti cytoplazmě neutrofilů)-asociovanými vaskulitidami (AAV) v různých stádiích onemocnění, s různou terapií a s ohledem na jejich dlouhodobou prognózu. Metodika: Vyšetřeno bylo 69 pacientů s AAV, 30 zdravých jedinců a 20 pacientů s chronickým onemocněním ledvin. Metodou průtokové cytometrie jsme u buněk periferní krve stanovovali následující markery: povrchové molekuly (CD4, CD8, CD3, CD19, CD80, CD86, HLA-DR, CD28, CXCR3, CCR5, CD30 a CRTH2) a intracelulární cytokiny (interferon gama (IFN), tumor nekrotizující faktor alfa (TNF), interleukin (IL)-2 a IL-4 v CD3+ T buňkách a IL-10 a IL-12 v monocytech). Výsledky: Pacienti s AAV měli ve srovnání se zdravými kontrolami snížený celkový počet lymfocytů, CD4+ buněk a CD4+CD45RA+ buněk (p<0.001). Aktivní pacienti měli zvýšenou expresi molekul CD30 a CRTH2 (p<0.05). Zvýšená exprese CCR5 přetrvávala i v remisi. Zvýšená exprese HLA-DR, expanze CD28 subpopulace a zvýšená produkce IFN byly pozorovány v remisi, ale ne u aktivní AAV. Pacienti v remisi, u kterých byl během dlouhodobého sledování zaznamenán relaps, měli významně nižší produkci IL-10 než ti bez relapsu (p<0.01). Závěry: Naše data celkově prokazují...
|
|
Role onkogenu erbB-2 v biologii rakovinných kmenových buněk
Prokopová, Kateřina ; Neužil, Jiří (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Nedávné výzkumy ukazují na přítomnost minoritní frakce nádorových buněk, která vykazuje určité "kmenové" vlastnosti. Tyto tzv. rakovinné kmenové buňky (RKB) se vyznačují relativně vyšší odolností k léčbě, tradičně zaměřené na diferencované a rychle se dělící buňky a proto mohou být příčinou relapsů nádorových onemocnění. RKB sdílejí specifickou expresi genů a deregulaci signálních drah. Jednou ze známých deregulací je zvýšená exprese receptoru erbB-2 (HER2), vyskytující se u ~25-30% případů rakoviny prsu. Zvýšená exprese erbB-2 receptoru je spojená se špatnou prognózou, zvýšeným proliferačním potenciálem a s rezistencí vůči chemoterapii. Dle nedávných výzkumů se při zvýšení hladiny erbB-2 zvyšuje i procento RKB v populaci nádorových buněk. V této diplomové práci jsme jako model RKB rakoviny prsu in vitro studovali tzv. mammosféry, rostoucí v médiu bez obsahu séra, do něhož jsou buňky postupně převáděny. Tyto buňky jsou CD44+ , vyznačují se zvýšenou expresí ABCG-2, Sox-2, Vimentinu a také vysokými hladinami erbB-2. Dále jsme připravili stabilní linii MCF7 buněk se sníženou hladinou erbB-2 pomocí shRNA plazmidu. V erbB-2- buňkách jsme charakterizovali expresi sady markerů RKB a sledovali schopnost těchto buněk iniciovat tvorbu nádoru v nahé myši pomocí ultrazvuku. Klíčová slova Rakovinné kmenové...
|
|
Molecular mechanisms of apoptosis regulation by fatty acids in pancreatic β-cells
Němcová, Vlasta ; Kovář, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Incidence diabetu 2. typu velmi rychle narůstá a představuje velkou hrozbu pro zdravotnictví i ekonomiku 21. století. Diabetes 2. typu je jasně asociován s obezitou a dysfunkce a apoptóza pankreatických β buněk v důsledku zvýšené hladiny mastných kyselin v krvi je považována za důležitý faktor přispívající k rozvoji tohoto onemocnění. Molekulární mechanismy zodpovědné za neblahé účinky mastných kyselin však nejsou dostatečne známy. Cílem tohoto výzkumného projektu bylo přispět k objasnění mechanismů, kterými nasycené a nenasycené mastné kyseliny regulují viabilitu a indukci apoptózy u lidských pankretických β buněk in vitro. U lidské β-buněčné linie NES2Y jsme ukázali, že zvýšené hladiny nasycených mastných kyselin přijímaných potravou (kyselina palmitová a stearová) indukují apoptózu pankreatických β buněk, narozdíl od příslušných nenasycených mastných kyselin (např. kyselina palmitolejová a olejová). Zjistili jsme, že apoptóza indukovaná kyselinou stearovou je doprovázena signifikantní aktivací kaspázy 2, 6, 7, 8 a 9, ale ne signifikantní aktivací kaspázy 3. Nebyla však spojena s vyléváním cytochromu c, změnou exprese proteinů PIDD, Fas a FasL a s aktivací proteinu p53. Působení kyseliny stearové vedlo k rychlé aktivaci signálních drah stresu endoplazmatického retikula (ER) (tj. IRE1α, PERK a...
|
|
Úloha komponent osy GH/IGF-1 v etiopatogeneze metabolických odchylek u diabetes mellitus 2. typu a akromegalie
Toušková, Věra ; Haluzík, Martin (vedoucí práce) ; Müllerová, Dana (oponent) ; Saudek, František (oponent)
(CZ) Komponenty osy GH/IGF-1 (růstový hormon (GH), receptor růstového hormonu (GH-R), inzulinu podobný růstový faktor-1 (IGF-1), IGF-1 receptor (IGF-1R), IGF-vazebné proteiny (IGFBPs)) hrají úlohu v regulaci glukózového metabolismu, zánětlivých pochodů stejně jako v proliferaci a diferenciaci buněk včetně adipocytů i monocytů. Cílem předkládané práce bylo prozkoumat úlohu lokálních změn mRNA exprese komponent osy GH/IGF-1 v podkožní tukové tkáni a periferních monocytech (PM) při rozvoji inzulinové rezistence a v regulaci obsahu tukové tkáně v organizmu u těchto skupin pacientů: u obézních subjektů s a bez přítomnosti diabetes mellitus 2. typu a u neléčených akromegaliků. V našich studiích jsme zkoumali celkem 66 subjektů, a to pacientky obézní bez diabetu 2. typu (OB), obézní diabetičky 2. typu (DM2), neléčené akromegaliky (AC) a zdravé kontrolní subjekty s normální hmotností (C). U obézních diabetiček byla provedena intervence zahrnující 2 týdny nízkokalorické diety (VLCD (very-low-calorie diet)-energetický obsah 2500 kJ/den). Dle našich výsledků se domníváme, že snížená mRNA exprese IGF-1, IGF-1R, IGFBP-2 a IGFBP-3 v tukové tkáni u obézních diabetiček 2. typu by mohla přispívat ke změnám diferenciační kapacity tukové tkáně a že zvýšená mRNA exprese IGF-1R v periferních monocytech těchto pacientek...
|
|
Molekulárně- genetická analýza karcinomů štítné žlázy
Sýkorová, Vlasta ; Bendlová, Běla (vedoucí práce) ; Zamrazil, Václav (oponent) ; Peterka, Miroslav (oponent)
Úvod: Nadory štitne žlazy představuji vice než 90% endokrinnich tumorů a jejich incidence, předevšim papilarniho karcinomu, se v Česke republice neustale zvyšuje. Je znamo několik genetickych přičin, ale jejich vliv na fenotyp je stále kontroverzni. Cíle: Studium genetickych přičin (RET/PTC, BRAF a RAS alteraci) a polymorfismů v RET genu u nadorů štitne žlazy (předevšim PTC) a korelace genotypu s fenotypem. Soubor a metody: Celkem bylo analyzovano 234 PTC tkani, 8 špatně diferencovanych karcinomů, 3 anaplasticke karcinomy, 23 medularnich karcinomů, 6 folikularnich karcinomů a jeden folikularni adenom. Pro analyzu byly použity vzorky zamraženych čerstvych tkani, biopsii tenkou jehlou a parafinovych bločků od pacientů s nadory štitne žlazy a vzorky krve od zdravych kontrol. Exprese RET/PTC přeskupeni byla detekovana na agarozovem gelu, RET polymorfismy byly analyzovany pomoci specifickych TaqMan sond. Detekce mutaci v BRAF genu a třech RAS genech byla provedena přimou sekvenaci. Zjištěne alterace byly korelovany s klinicko-patologickymi parametry. Výsledky: Zjistili jsme, že některe polymorfismy v RET genu asociuji se vznikem RET/PTC přeskupeni u PTC a prokazali jsme, že BRAF mutace koreluje s větši agresivitou tumoru. V RAS genech jsme nalezli několik genetickych změn. Závěr: Studie přinesla...
|
|
Plasma-membrane alkali-metal-cation transporters involved in salt tolerance of pathogenic Candida species
Krauke, Yannick ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
of Ph.D. Thesis Conclusions All the aims of the thesis were achieved. The tolerance to alkali metal cations of four pathogenic Candida species was studied in detail and revealed differences among the yeasts. These differences in sall tolerance remained the same under various growth conditions. For the first time, the internal sodium and potassium concentrations of several Candida species were estimated under high salt-stress grolvth. The internal K./Na* ratio was not in relation with the salt tolerance revealing different adaptation mechanisms to salt stress in Candida species. A first study on combinatory use of fluconazole and NaCl revealed severe synergistic effects of both compounds, leading to grovvth inhibition and increased internal Na* concentrationsi n C. albicans.T he molecularb asis of this synergismr emains to be established. Ihe C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapsilosis Cnhl NalH- antiporters were cloned and functionally characterized upon heterologous expression in S. cerevlslae to understand the mechanisms involved in the different salttolerances of Candida species. The three antiporters differed in their activity for alkali metal cations, which roughly correlated with the observed differences in salt tolerance among the species. Additionally, during the characterization of...
|
|
Vývoj světelné synchronizace cirkadiánního systému v časné postnatální ontogenezi
Matějů, Kristýna ; Sumová, Alena (vedoucí práce) ; Höschl, Cyril (oponent) ; Langmeier, Miloš (oponent) ; Nevšímalová, Soňa (oponent)
U většiny organismů bylo pozorováno množství rytmických dějů, které běží i v prostředí bez periodických podnětů s periodou ± 24 hod (tzv. cirkadiánní rytmy). U savců jsou centrem, které řídí vznik cirkadiánních rytmů suprachiasmatická jádra hypothalamu (SCN). Světlo synchronizuje cirkadiánní rytmy s 24-hodinovým dnem. Informace o světle se dostává do SCN ze sítnice a u dospělých potkanů působí indukci exprese hodinových genů Period1 a Period2, které představují fotosensitivní část molekulárního mechanismu cirkadiánních hodin v SCN. Tato citlivost na světlo je cirkadiánními hodinami omezena (vrátkována) na dobu tzv. subjektivní noci. Rytmická exprese těchto i dalších hodinových genů v SCN je navíc u dospělých potkanů modulována délkou světlé části dne (fotoperiodou). Cílem práce bylo zmapovat jak se během prenatální a postnatální ontogeneze potkana vyvíjejí mechanismy synchronizace cirkadiánních rytmů světlem. Výsledky ukazují, že během prenatálního a časného postnatálního období dostávají cirkadiánní hodiny mláděte informaci o světle zprostředkovaně přes cirkadiánní systém matky. Cirkadiánní hodiny v SCN jsou citlivé na světlo již 1. postnatální den. Mechanismus vrátkující citlivost ke světlu je přítomen 3. postnatální den a do 10. postnatálního dne se dále vyvíjí. Výsledky rovněž naznačují, že sítnice...
|
host ::
