|
Proteome and Metabolome Changes in Selected Organisms under Stress
Halienová, Andrea ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Čertík, Milan (oponent) ; Šucman, Emanuel (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Living conditions of every organism are influenced by various factors at this time. Some of them have positive effect on organism, some negative. Basic condition for surviving is the ability to resist and adapt to changing metabolic and living conditions. Every single stress effect can lead to changes in metabolism but organisms have ability to develope sufficient mechanisms for stress response. Some of them are similar for all living organisms (enzyme production, endogenous primary stress metabolites) some of them are specific for certain organism or stress type. Cell stress response can be observed on different levels (proteomic, genomic, metabolomic). In proper conditions it can be used indrustrially. In this work, influences of various stress factors were studied. These factors were applied on selected organisms – carotenogenic yeast and plant materials. Yeast stress response was induced by osmotic and oxidation stress factors. Changes on proteomic level and in production of selected secondary metabolites were observed. Proteome was analyzed by 1D and 2D electrophoresis with subsequent analysis of proteins by mass spectrometry. Yeast strain Rhodotorula glutinis CCY 20-2-26 showed the best adaptation to stress factors, which was moreover accompanied by overproduction of carotenoids. This finding can be premise for next industrial production of carotenoids. In plant samples predominantly enzymes and metabolites involved in antioxidant response were studied.
|
|
Microbial Degradation of Polycaprolactone-based Materials
Damborský, Pavel ; Stratilová, Eva (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The thesis deals with the issue of the effect of nutritious factors and aeration on Bacillus subtilis (CCM 1999) lipase production, which was studied from the viewpoint of the crucial action of lipases on polyester chains degradation. The parameters such as bacterial growth, lipolytic activity, pH optimum, temperature optimum, thermal stability, proteolytic activity, the amount of proteins, etc. were determined in three types of media inoculated by Bacillus subtilis. One sample set of media: peptone and yeast extract (NB), medium consisted in peptone and yeast extract with the addition of 2% (w/v) glucose (NBG) and mineral solution with yeast extract (MS-YE) contained poly(-caprolactone), PCL film (Mn = 10 kDa, = 1.4). Experiments were performed for 21 days under shaking at 160 and 200 rpm. The presence of PCL caused in both types of media (NB, NBG) higher values of lipolytic activity of Bacillus subtilis indicating the participation of released low-molecular weight species as the products of PCL biodegradation. In BS-inoculated MS-YE medium low lipolytic activity of Bacillus subtilis as compared with those measured in NB and NBG media was determined even in the presence of PCL. During experiment pH value shifted from neutral (pH 7.0) to alkaline (pH 8.5 – 9.3) region for all types of media with and without PCL specimens. This fact indicates negligible pH changes in microenvironment due to the degradation products and/or metabolites. Lipolytic enzymes determined in supernatants free of bacterial cells have shown two pH optima in the presence of PCL, at pH 7 and 9. Lipase in the absence of polymer displayed optimum pH of 7. Measurement of thermal stability demonstrated that extracellular lipases as relative thermostable enzyme especially in the absence of polymer. The basic proteomic analysis by peptide mass fingerprint (PMF) of lipases produced by Bacillus subtilis at NBG medium after one week of cultivation was performed. The presence of proteins with molecular weight (19.3 kDa) close to that reported for lipases was verified through FPLC. Both SDS-PAGE and IEF-PAGE indicated presence of these proteins in both studied media (NBG vs. NBG/PCL). However, no differences have been found in the presence of PCL and no lipase was truly identified through MALDI-TOF mass spectrometry. The occurrence of degradation process in PCL samples was also documented by their gradual weight loss, which was seen in all media types as the synergic effect of lipase- and base-catalyzed ester bond scission. Model degradation study of PCL and its composite with graphene oxide (2.7 wt% GO) was performed in the presence of Bacillus subtilis in NBG medium at 30 °C and initial pH 7 for three weeks. The weight loss of PCL films gradually increased during whole degradation test up to 12 wt%. Degradation of PCL/GO composite proceeds slower as documented by maximum weight loss of 5.0 wt%. The similar character of elution curves of both PCL and its composite, determined by SEC analysis, indicated shifting to lower molecular region.
|
|
Vliv volných radikálů na stárnutí
Lukšanová, Hana ; Wilhelm, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Macháčková, Ivana (oponent)
Cílem této studie bylo ověřit platnost Harmanovy teorie stárnutí, založené na působen í volných ra dikálů, na nových modelech stárnutí rostlin a kvasinek, jelikož tyto organizmy byly nedávno přijaty mezinárodní komunitou jako uznávané modely pro studium mechanizmu stárnutí na molekulární úrovni. Vzhledem k tomu, že v Harmanově teorii stárnutí má centrální význam endogenní produkce volných radikálů, zaměřila jsem se ve své studii na sledování časového průbě hu vzniku jejich koncových produktů . Paralelně jsem sledovala změny antioxid a ční ch systémů, které rozhodují o rozsahu poškození vyvolaném volnými radikály. V poslední době se ukazuje, že procesů stárnutí se účastní i reaktivní slo u čen iny dusíku, a proto jsem zaměři l a pozornost i na mechanizmy zahrnující účast těchto sloučenin. Jako modelové organizmy jsem použila fazol (Phaseo/us vu/garis L.), trasgenní rostliny tabáku (Nicotiana tabacum L. ) s pozměněnou koncentrací cytokininů, husen íček rolní (Arabidopsis tha/iana) a kvasinky (Saccharomyces cerevisiae). Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
Proteomic Analysis of Gamma-Irradiated Human Leukemic Cells
Šalovská, Barbora ; Řezáčová, Martina (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Ebhardt, H. Alexander (oponent)
(CZE) Název dizertační práce: Proteomická analýza leukemických buněčných linií po ozáření V této dizertační práci jsme se zaměřili na objasnění molekulárních mechanismů radiosensibilizace leukemické buněčné linie MOLT-4 specifickou inhibicí kináz z rodiny fosfatidylinositol-3-kináza příbuzných kináz (PIKKs). Byly testovány dva vysoce účinné a selektivní inhibitory VE-821 (inhibitor ATR) a KU55933 (inhibitor ATM), pro jejich účinky na proliferaci, viabilitu a buněčný cyklus neozářených a ozářených buněk MOLT4. Aplikace obou inhibitorů způsobila radiosensibilizaci MOLT-4 buněk a 10 µM VE-821 navíc působil jako silné antiproliferativní agens i v neozářených MOLT-4 buňkách. K dalšímu popisu mechanismů, které jsou zodpovědné za radiosensibilizaci MOLT-4 buněk VE-821 inhibitorem byly použity hmotnostně spektrometrické metody. Pomocí metod kvantitativní proteomiky jsme identifikovali a kvantifikovali změny v proteomu a fosfoproteomu (tj. změny na úrovni fosforylace proteinů) buněk, které byly způsobeny účinkem inhibitoru v ozářených buňkách. Protože detekce a kvantifikace fosforylovaných peptidů v komplexních vzorcích je komplikována mimo jiné jejich relativně nízkým zastoupením, zaměřili jsme se nejprve na výběr optimální metody pro jejich selektivní izolaci ze směsi s nemodifikovanými peptidy....
|
|
Molecular Study of Intracellular Changes as Response of Microorganisms to Environment
Čarnecká, Martina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
In nature yeast cells live in a rapidly changing environment. In order to survive constant fluctuations in their external surroundings cells quickly and effectively adapt their internal systems to meet the challenges of each new environment. One aspect of this cellular adaptation is the reorganization of genomic expression to the program required for growth in each environment. This genomic reorganization results in altered cell’s metabolome and physiology. The molecular responses elicited by the cells dictate whether the organism adapts, survives or, if injured beyond repair, undergoes death. In this work, genomic, proteomic and metabolic profiles of some carotenogenic yeasts grown in optimal and stress conditions were compared. To increase the yield of carotenoid pigments, several types of environmental changes as well as nutrition stress were applied. Yeasts were cultivated under osmotic, oxidative and metal stress, on different carbon sources or on various waste materials (whey, potato extract). Some chemical and UV mutants were also prepared and tested. Changes on yeast metabolome level were studied by RP-HPLC/MS technique used to carotenoid analysis. Another possibility to study stress response is preparation of transformed cells with deletion of definite genes. For setup, the method was first optimized for fission yeasts Schizosaccharomyces pombe. Technique is based on knockout constructs that contain regions homologous to the target gene cloned into vectors carrying dominant drug-resistance markers. As transformation vector plasmid pCloneKanmx confering resistance to geneticine was used. The vector and constructs were digested by relevant restriction endonucleases, ligated, amplified in E.coli and transformed into the yeast Schizosaccharomyces pombe sp286. Positive transformants were selected according to resistance to geneticine and checking PCR products. By analysis of transformants proteins required for meiotic chromosome segregation were identified.
|
|
Species Discrimination and Monitoring of Abiotic Stress Tolerance by Chlorophyll Fluorescence Transients
MISHRA, Anamika
Zobrazování kinetiky fluorescence chlorofylu se stalo univerzálním nástrojem v základním i aplikovaném výzkumu rostlin. Tato metoda zachycuje casovou radu dvourozmerných obrazu distribuce fluorescence chlorofylu v ploše listu nebo celých rostlin v ruzné ozárenosti; typickým protokolem je kombinace aktinického svetla a saturacních pulzu. V minulosti bylo identifikováno nekolik parametru fluorescence chlorofylu, které mají fyziologickou interpretaci a jsou duležité napr. pro hodnocení zdravotního stavu rostlin a pro vcasnou detekci biotického i abiotického stresu rostlin. Zobrazování urcitých fyziologicky relevantních parametru fluorescence chlorofylu nám umožnilo zkoumat fotosyntetickou úcinnost rostlin, jejich fyziologickou odpoved v ruzných cástech listu i celých rostlin. Standardní fluorescencní indexy používají bud jeden základní fluorescencní parametr (F0, Fp, Fm, Fs), nebo aritmetickou kombinaci základních parametru (Fv/Fm, PSII, NPQ, qP). Ackoliv tyto standardní fluorescencní parametry mají fyziologickou interpretaci, jejich distribuce v ploše listu/rostiny nekdy nemusí poskytovat informaci o casné fázi stresu rostlin. Proto je nekdy duležité najít nejvíce kontrastní obrázky jiných fluorescencních parametru tak, aby kvantifikovaly stresovou reakci rostliny v její rané fázi. Pro výber vysoce kontrastních obrazu fluorescence chlorofylu ze stovek porízených snímku behem casové rady byly vyvinuty pokrocilé statistické techniky založené na klasifikátorech a feature selection metodách. Metoda combinatorial imaging vyvinutá v naší laboratori využívá kombinaci nekolika obrázku fluorescencních parametru, nezávisle na jejich fyziologické interpretaci, k vytvorení co nejkontrastnejšího obrázku pro potreby zobrazení napr. vcasné fáze stresu, rozlišení príbuzných druhu rostlin v porostu apod. Proto aplikace pokrocilých statistických metod na fluorescencní data umožnuje uspet v úkolech, kde konvencní prístupy nefungují. Tato práce se snaží poskytnout srovnání možností využití standardních fluorescencních parametru a pokrocilých statistických metod (použití ruzných klasifikátoru a feature selection metod) aplikovaných na fluorescencní data pro high-throuhput screening. Demonstrujeme použitelnost techto prístupu pro rozlišení ze trí druhu stejného rodu Lamiaceae ve velmi rané fázi rustu. Dále ukazujeme, že zobrazování fluorescence chlorofylu lze použít pri merení tolerance rostlin na chlad a sucho u husenícku (Arabidopsis thaliana) a rajcat, a to v simulovaných high-throuhput screening pokusech.
|
| |
|
Aromatické nitrosloučeniny ve složkách životního prostředí a jejich vliv na organismy
Rohlenová, Terezie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Aromatické nitrosloučeniny jsou významnými kontaminanty vyskytujícími se ve všech složkách životního prostředí. Vznikají z oxidů dusíku, který je produkován při vysokoteplotních spalovacích procesech, a z polycyklických aromatických uhlovodíků. Aromatické nitrosloučeniny jsou významnou součástí výfukových plynů automobilové dopravy, cigaretového kouře a sazí vznikajících při spalování dřeva. Většina z nich vykazuje mutagenní aktivitu v bakteriálních a savčích systémech. Mnohé z nich se podílejí na nádorových procesech. Cílovými orgány jejich karcinogenního působení jsou zejména plíce, játra a prsní žlázy. Bakalářská práce popisuje metabolismus a karcinogenní působení některých aromatických nitrosloučenin: 2-nitroanisolu, 4-nitroanisolu, 3-nitrobenzathronu, 2- nitrobenzanthronu, 2-nitrotoluenu, 2,4-dinitrotoluenu a 2,6-dinitrotoluenu, 2,4,6- trinitrotoluenu. 2-Nitroanisol se používá jako prekurzor k výrobě o-anisidinu, který je užíván k výrobě azobarviv a pigmentů k barvení textilu a papíru. Obě tyto sloučeniny vykazují silnou karcinogenní aktivitu na hlodavcích. 4-Nitroanisol je produktem metabolické methylace 4- nitrofenolu (p-nitrofenolu). 4-Nitrofenol se používá k výrobě barviv a fungicidů. A protože se akumuluje v přírodních složkách, je označen jako polutant životního prostředí. 3-...
|
|
Applications of capillary electrophoresis in life sciences
Křížek, Tomáš ; Coufal, Pavel (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
Tomáš Křížek: Využití kapilární elektroforézy ve vědách o životě (Disertační práce) ABSTRAKT Tato práce se zabývá využitím kapilární elektroforézy ve dvou významných oblastech "věd o životě", konkrétně v proteomice a stanovení aktivity enzymů. V první části jsou studovány vlastnosti polymeru Pluronic F-127 jako separačního média v kapilární gelové elektroforéze. Byl zkoumán vliv termoasociace Pluronicu F-127 na selektivitu separace peptidů a aminokyselin, přičemž při teplotách pod, uvnitř a nad oblastí termoasociace žádný rozdíl v selektivitě pozorován nebyl. Funkce Pluronicu F-127 v kapilární gelové elektroforéze byla porovnána s dextranem, jakožto běžně používanou gelovou matricí. Výsledky ukazují, že Pluronic F-127 je výhodnějším médiem pro separace nízkomolekulárních bílkovin, protože poskytuje větší separační sílu při zachování nižší viskozity základního elektrolytu. Tato nižší viskozita usnadňuje výměnu základního elektrolytu po každém měření, což vede k výrazně vyšší opakovatelnosti pokusů. Dextran je na druhé straně díky své vyšší viskozitě vhodnější pro separace peptidových štěpů bílkovin, při kterých je zásadním parametrem vysoká účinnost separace. Druhá část práce je zaměřena na elektroforetická stanovení aktivity enzymů. Byla vyvinuta nová metoda separace N,N',N''-triacetylchitotriosy,...
|
|
Vliv modulace hladin cytokininů na fenom a proteom rostlin
Koukalová, Vladěna
Limitujícími prvky zemědělské produkce jsou zejména negativně působící biotické a abiotické stresory prostředí. Jejich dopady se snaží minimalizovat molekulárně genetické přístupy, které hledají řešení v geneticky modifikovaných organismech s vyšší odolností. Současná legislativa však velice limituje využití GMO, a proto se rovněž hledají jiné cesty, jak docílit stejných účinků. Jednou z cest je hledání farmak, které budou mít pozitivní vliv na obranu rostlin proti stresorům prostředí. Tato práce je věnována charakterizaci látky INCYDE, která blokuje degradaci rostlinných hormonů cytokininů, které jsou známy svými pozitivními účinky na oddalování stárnutí rostlin a zvýšení odolnosti rostlin vůči extrémnímu suchu. Klasickou bioesejí sledováním délky hlavního kořene bylo prokázáno, že působení látky INCYDE je srovnatelné s působením jednoho z nejaktivnějších cytokininů trans-zeatinu. Analýzou linií s pozměněnou signalizací kanonické signalizační dráhy cytokininů bylo ověřeno, že pro změny sledovaných morfologických parametrů nevyužívají INCYDE a trans-zeatin rozdílných složek cytokininové signalizace. Navzdory tomu, že mají INCYDE a trans-zeatin podobné účinky, analýza proteomu odhalila odlišnosti v působení těchto látek. Tyto rozdíly budou předmětem následných analýz.
|
host ::
