|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Indukce a průběh programované buněčné smrti v nádorových buňkách po aplikaci taxanů
Kábelová, Adéla ; Jelínek, Michael (vedoucí práce) ; Gemperle, Jakub (oponent)
Taxany jsou třídou běžně užívaných protinádorových léčiv zvláště účinných u nádorových onemocnění prsu, vaječníku, prostaty či plic. Taxany se váží se na β-tubulinovou podjednotku mikrotubulů, čímž vedou k jejich stabilizaci a inhibici depolymerizace. Takovéto mikrotubuly nejsou schopny tvořit funkční mitotické vřeténko a dochází k zablokování buněčného cyklu v G2/M fázi a následné apoptóze. Některé buňky si však k taxanům vyvinuly různé mechanismy rezistence. Ty mohou souviset s cílovým místem pro vazbu taxanů, tj. mikrotubuly nebo mohou být výsledkem zvýšené exprese specifických přenašečů, které odčerpávají taxany ven z buňky. Další typy rezistence jsou spojeny s procesem programované buněčné smrti (PCD), konkrétně s proteiny, které se po aplikaci taxanů podílí na jejím zdárném průběhu. K těmto proteinům patří rodina Bcl-2, která reguluje iniciaci PCD udržováním integrity membrány mitochondrií a endoplasmatického retikula a jejichž aktivita může být taxany přímo či nepřímo ovlivňována. Výkonnou složkou PCD jsou kaspázy, kde zvláště důležitou se zdá být kaspáza-2 aktivovaná v důsledku taxany-indukovaného cytoskeletárního poškození. V některých případech mohou taxany vést k buněčné smrti nezávisle na kaspázách. Zvláštní úlohu má protein p53, který se do apoptózy indukované taxany zapojuje pouze při aplikaci...
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Role of cytoskeleton in plant cell morphogenesis
Miklánková, Pavlína ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Sekereš, Juraj (oponent)
Bunky sú schopné nadobúdať nepreberné množstvo tvarov, v čom hrá dôležitú úlohu cytoskelet. Ovplyvňuje depozíciu materiálov bunečnej steny, reguluje pohyb vačkov po bunke, podieľa sa na exocytóze a endocytóze. Kortikálne mikrotubuly ovplyvňujú ukladanie celulózy do bunečnej steny a tým udávajú smer bunečnej expanzie, hoci presný súvis medzi mikrotubulami a celulózou zostáva nevyjasnený. Aktín podporuje rast a prispieva k jeho priestorovej regulácii vo vrcholovo aj difúzne rastúcich bunkách. Je dôležitý pri sekrécii v expandujúcich bunkách, ale jeho presné funkcie pri riadení bunečného rastu nie sú ešte celkom vysvetlené. Pre lepšie pochopenie, ako spolu súvisia aktínový a mikrotubulárny cytoskelet v morfogenéze rastlinných buniek, sa používajú analýzy mutantov, spektroskopické metódy, cytoskeletárne jedy, fluorescenčné proteíny a ďalšie metódy. Dobrým modelom pre výskum sú epidermálne a trichómové bunky Arabidopsis thaliana, na ktorých prebieha väčšina štúdii.
|
|
|
Hledání mechanismů a funkce interakce mikrotubulárního cytoskeletu s dalšími složkami v rostlinné buňce
Krtková, Jana ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent) ; Ovečka, Miroslav (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet se v rostlinných buňkách účastní mnoha důležitých dějů během dělení, růstu a vývoje. Výkon jeho četných funkcí je však umožněn interagujícími proteiny, které jednak modulují jeho dynamiku a organizaci, jednak umožňují funkční či strukturní propojení s dalšími složkami rostlinné buňky. Identifikace zprostředkovatelů těchto interakcí a jejich fyziologická funkce za specifických podmínek byla hlavní náplní předkládané dizertační práce. Pomocí biochemických metod byly identifikovány membránové proteiny, které zároveň kosedimentují s mikrotubuly. Překvapivě mezi nimi nebyli žádní zástupci klasických konzervovaných proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAP), ale jednalo se o enzymy, chaperony a rostlinně specifické proteiny. Pro další studium jeho role související s rostlinnými mikrotubuly byl vybrán identifikovaný heat-shock protein 90 (Hsp90_MT). Rekombinantní Hsp90_MT se váže přímo na mikrotubuly a dimery tubulinu in vitro. Za vazbu není zodpovědná jeho ATP-vazebná doména. Hsp90_MT v BY-2 kolokalizuje s mikrotubuly fragmoplastu i s kortikálními mikrotubuly a podílí se na obnově mikrotubulů po jejich depolymeraci způsobené chladem. Dále se Hsp90 účastní postupu buněčného cyklu, jeho inhibice u rostlinných buněk blokuje buněčný cyklus v G1 fázi. Na základě literárního studia...
|
|
|
MAPs, proteiny asociované s mikrotubuly v rostlinných buňkách
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
1. Abstrakt a klíčová slova Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur. Jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny, které můžeme zahrnout do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Výzkum MAP a jejich různorodých funkcí se v posledních letech prudce rozvíjí. Některé MAP ovlivňují dynamiku MT, jiné mají spíše strukturní funkci - propojují jednotlivá MT vlákna s rozličnými buněčnými strukturami, jako jsou ostatní MT, proteiny, organely, aktinový cytoskelet či plasmatická membrána. Mnoho popsaných MAP proteinů má homology v rámci celé eukaryotické říše, příkladem je rodina MAP65 nebo EB1 (END BINDING 1), je proto zajímavé sledovat, zda a jak se rostlinné MAP svými funkcemi liší od svých živočišných homologů. Na druhou stranu jsou popsány také rostlinně specifické MAP s unikátními funkcemi v rostlinné buňce, například ATK5 či SPR1 (SPIRAL 1). Tato bakalářská práce je literární rešerší, jejímž cílem je zpracovat přehled rostlinných MAP, charakterizovat je a popsat, pokud jsou známy, jejich funkce z hlediska buňky i celého rostlinného organismu. Klíčová slova: cytoskelet, mikrotubuly, proteiny asociované s mikrotubuly, rostlinná buňka, růst a vývoj
|
|
|
Analýza lokalizace endomembránových markerů v kortikální vrstvě rostlinných buněk a jejich interakce s komplexem Arp2/3
Jelínková, Barbora ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
ARP2/3 je evolučně konzervovaný heterohemptamerický proteinový komplex. Jeho hlavní aktivitou je nukleace větvených aktinových vláken za účelem remodelace membrán. ARP2/3 se účastní remodelace plazmatické membrány a tvorby cytoplazmatických výběžků sloužících k pohybu u živočišných buněk a améboidních prostist a účastní se exocytózy a endocytózy u živočichů a kvasinek. Cílem této práce bylo pokusit se najít souvislost komplexu ARP2/3 s regulací endomembránového systému u rostlin. Pomocí TIRF mikroskopie byla prozkoumána lokalizace komplexu ARP2/3 v kortikální vrstvě rostlinných buněk a porovnána s lokalizací endomembránových markerů ze skupiny Rab a exocytotickým markerem Exo84b. Podjednotky komplexu ARP2/3 lokalizovaly v blízkosti plazmatické membrány do dynamických teček nejvíce se podobajících lokalizaci Exo84b proteinu. Kolokalizační analýza ukázala malou míru kolokalizace signálu Exo84b a ARP2/3 a tento výsledek byl podpořen biochemickým přístupem koimunoprecipitace. Klíčová slova: ARP2/3, endomembránový systém, kortikální vrstva, RabA1g, RabC1, RabD2a, Exo84b,
|
|
|
Regulatory mechanisms of centrosomal microtubule nucleation
Klebanovych, Anastasiya ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
SOUHRN Organizace a dynamika mikrotubulů se mění s ohledem na potřeby buňky při jejím růstu, dělení a diferenciaci, a také při vnitrobuněčném transportu i přenosu signálů. Centrozomální mikrotubuly se tvoří pomocí γ-tubulinových komplexů (γTuRC). Ačkoliv signální dráhy regulující mikrotubulární nukleaci zůstávají do značné míry neznámé, posttranslační modifikace stavebních proteinů γTuRC a jejich interakčních partnerů hrají důležitou úlohu při modulaci nukleace. V předkládané disertační práci jsme funkčně charakterizovali úlohu protein tyrosin fosfatázy SHP-1 a E3 UFM-protein ligázy 1 (UFL1) interagující s proteinem CDK5RAP3 (C53) při regulaci centrozomální mikrotubulární nukleace. Rovněž jsme v tomto procesu objasnili roli profilinu 1, regulačního proteinu aktinových filament. Zjistili jsme, že SHP-1 v žírných buňkách kostní dřeně (BMMC) tvoří komplexy s γTuRC proteiny a inhibuje nukleaci mikrotubulů snížením množství γ-tubulinu/γTuRC v centrozómech. Navrhli jsme nový mechanismus, při kterém aktivní centrozomální Syk kináza, fosforylovaná na tyrosinu a regulovaná SHP-1, moduluje nukleaci mikrotubulů během aktivace BMMC pomocí antigenu. Poprvé jsme ukázali, že proteinový komplex UFL1/C53 se může podílet na regulaci nukleace mikrotubulů. Protein C53, jehož množství je regulováno UFL1, se váže na centrozómy....
|
|
|
Mechanismy dynamiky a nukleace mikrotubulů v rostlinné buňce
Mauerová, Zdeňka ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Žárský, Viktor (oponent)
Nukleace mikrotubulů spoluurčuje organizaci této složky cytoskeletu v buňkách a význač- ným dílem přispívá k utváření její dynamiky. V rostlinných buňkách se uplatňuje přede- vším na preexistujících mikrotubulech závislá nukleace, která se odehrává v kortikální oblasti a také v rámci dělícího vřeténka a fragmoplastu. Rekrutování γTuRC, univerzál- ního konzervovaného nukleátoru, na stěnu mikrotubulů zajišt'uje augmin ve spolupráci s NEDD1/GCP-WD. Funkce γTuRC je přinejmenším při nukleaci ve vřeténku, ale zřejmě i v ostatních případech dále posilována XMAP215/MOR1, který zvyšuje jeho efektivitu svojí polymerační aktivitou, a TPX2, eventuálně jeho homology, jenž jednak komplex přímo aktivuje, jednak tvorbou kondenzátu s tubulinovými dimery lokálně navyšuje jejich koncen- traci, což také zvyšuje pravděpodobnost úspěšného uskutečnění nukleace. O regulačních drahách kontrolujících tento proces se toho příliš neví, s výjimkou TTP komplexu činného v kortexu. Celkově jsou znalosti o nukleaci v rostlinách spíše skrovné a informace týkající se molekulárních mechanismů fungování uvedených faktorů pocházejí převážně z výzkumu na živočišných modelech. Klíčová slova augmin, cytoskelet, γTuRC, mikrotubuly, nukleace, rostlinná buňka
|
host ::
RSS.