|
|
Hafnium Chloride, an Alternative Staining Reagent for Biological Electron Microscopy
BARANYI, Magdalena Victoria
This study focuses on the staining pattern of the non-radioactive heavy metal EM stain HfCl4, used during freeze substitution specimen preparation. HfCl4 was investigated as an alternative for the prominent uranyl acetate, since uranium based materials have been placed under heavy restrictions and bans worldwide. We have found a strong HfCl4 staining pattern of microtubules in myoepithelial cells of Ixodes ricinus salivary glands. Additionally, in several samples, HfCl4 was found to completely fill the cytoplasm of the myoepithelial cells. Nonetheless, artefact formation around granulated cells was also experienced.
|
|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Indukce a průběh programované buněčné smrti v nádorových buňkách po aplikaci taxanů
Kábelová, Adéla ; Jelínek, Michael (vedoucí práce) ; Gemperle, Jakub (oponent)
Taxany jsou třídou běžně užívaných protinádorových léčiv zvláště účinných u nádorových onemocnění prsu, vaječníku, prostaty či plic. Taxany se váží se na β-tubulinovou podjednotku mikrotubulů, čímž vedou k jejich stabilizaci a inhibici depolymerizace. Takovéto mikrotubuly nejsou schopny tvořit funkční mitotické vřeténko a dochází k zablokování buněčného cyklu v G2/M fázi a následné apoptóze. Některé buňky si však k taxanům vyvinuly různé mechanismy rezistence. Ty mohou souviset s cílovým místem pro vazbu taxanů, tj. mikrotubuly nebo mohou být výsledkem zvýšené exprese specifických přenašečů, které odčerpávají taxany ven z buňky. Další typy rezistence jsou spojeny s procesem programované buněčné smrti (PCD), konkrétně s proteiny, které se po aplikaci taxanů podílí na jejím zdárném průběhu. K těmto proteinům patří rodina Bcl-2, která reguluje iniciaci PCD udržováním integrity membrány mitochondrií a endoplasmatického retikula a jejichž aktivita může být taxany přímo či nepřímo ovlivňována. Výkonnou složkou PCD jsou kaspázy, kde zvláště důležitou se zdá být kaspáza-2 aktivovaná v důsledku taxany-indukovaného cytoskeletárního poškození. V některých případech mohou taxany vést k buněčné smrti nezávisle na kaspázách. Zvláštní úlohu má protein p53, který se do apoptózy indukované taxany zapojuje pouze při aplikaci...
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Role of cytoskeleton in plant cell morphogenesis
Miklánková, Pavlína ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Sekereš, Juraj (oponent)
Bunky sú schopné nadobúdať nepreberné množstvo tvarov, v čom hrá dôležitú úlohu cytoskelet. Ovplyvňuje depozíciu materiálov bunečnej steny, reguluje pohyb vačkov po bunke, podieľa sa na exocytóze a endocytóze. Kortikálne mikrotubuly ovplyvňujú ukladanie celulózy do bunečnej steny a tým udávajú smer bunečnej expanzie, hoci presný súvis medzi mikrotubulami a celulózou zostáva nevyjasnený. Aktín podporuje rast a prispieva k jeho priestorovej regulácii vo vrcholovo aj difúzne rastúcich bunkách. Je dôležitý pri sekrécii v expandujúcich bunkách, ale jeho presné funkcie pri riadení bunečného rastu nie sú ešte celkom vysvetlené. Pre lepšie pochopenie, ako spolu súvisia aktínový a mikrotubulárny cytoskelet v morfogenéze rastlinných buniek, sa používajú analýzy mutantov, spektroskopické metódy, cytoskeletárne jedy, fluorescenčné proteíny a ďalšie metódy. Dobrým modelom pre výskum sú epidermálne a trichómové bunky Arabidopsis thaliana, na ktorých prebieha väčšina štúdii.
|
|
|
Hledání mechanismů a funkce interakce mikrotubulárního cytoskeletu s dalšími složkami v rostlinné buňce
Krtková, Jana ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent) ; Ovečka, Miroslav (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet se v rostlinných buňkách účastní mnoha důležitých dějů během dělení, růstu a vývoje. Výkon jeho četných funkcí je však umožněn interagujícími proteiny, které jednak modulují jeho dynamiku a organizaci, jednak umožňují funkční či strukturní propojení s dalšími složkami rostlinné buňky. Identifikace zprostředkovatelů těchto interakcí a jejich fyziologická funkce za specifických podmínek byla hlavní náplní předkládané dizertační práce. Pomocí biochemických metod byly identifikovány membránové proteiny, které zároveň kosedimentují s mikrotubuly. Překvapivě mezi nimi nebyli žádní zástupci klasických konzervovaných proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAP), ale jednalo se o enzymy, chaperony a rostlinně specifické proteiny. Pro další studium jeho role související s rostlinnými mikrotubuly byl vybrán identifikovaný heat-shock protein 90 (Hsp90_MT). Rekombinantní Hsp90_MT se váže přímo na mikrotubuly a dimery tubulinu in vitro. Za vazbu není zodpovědná jeho ATP-vazebná doména. Hsp90_MT v BY-2 kolokalizuje s mikrotubuly fragmoplastu i s kortikálními mikrotubuly a podílí se na obnově mikrotubulů po jejich depolymeraci způsobené chladem. Dále se Hsp90 účastní postupu buněčného cyklu, jeho inhibice u rostlinných buněk blokuje buněčný cyklus v G1 fázi. Na základě literárního studia...
|
|
|
MAPs, proteiny asociované s mikrotubuly v rostlinných buňkách
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
1. Abstrakt a klíčová slova Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur. Jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny, které můžeme zahrnout do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Výzkum MAP a jejich různorodých funkcí se v posledních letech prudce rozvíjí. Některé MAP ovlivňují dynamiku MT, jiné mají spíše strukturní funkci - propojují jednotlivá MT vlákna s rozličnými buněčnými strukturami, jako jsou ostatní MT, proteiny, organely, aktinový cytoskelet či plasmatická membrána. Mnoho popsaných MAP proteinů má homology v rámci celé eukaryotické říše, příkladem je rodina MAP65 nebo EB1 (END BINDING 1), je proto zajímavé sledovat, zda a jak se rostlinné MAP svými funkcemi liší od svých živočišných homologů. Na druhou stranu jsou popsány také rostlinně specifické MAP s unikátními funkcemi v rostlinné buňce, například ATK5 či SPR1 (SPIRAL 1). Tato bakalářská práce je literární rešerší, jejímž cílem je zpracovat přehled rostlinných MAP, charakterizovat je a popsat, pokud jsou známy, jejich funkce z hlediska buňky i celého rostlinného organismu. Klíčová slova: cytoskelet, mikrotubuly, proteiny asociované s mikrotubuly, rostlinná buňka, růst a vývoj
|
|
|
Analýza lokalizace endomembránových markerů v kortikální vrstvě rostlinných buněk a jejich interakce s komplexem Arp2/3
Jelínková, Barbora ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
ARP2/3 je evolučně konzervovaný heterohemptamerický proteinový komplex. Jeho hlavní aktivitou je nukleace větvených aktinových vláken za účelem remodelace membrán. ARP2/3 se účastní remodelace plazmatické membrány a tvorby cytoplazmatických výběžků sloužících k pohybu u živočišných buněk a améboidních prostist a účastní se exocytózy a endocytózy u živočichů a kvasinek. Cílem této práce bylo pokusit se najít souvislost komplexu ARP2/3 s regulací endomembránového systému u rostlin. Pomocí TIRF mikroskopie byla prozkoumána lokalizace komplexu ARP2/3 v kortikální vrstvě rostlinných buněk a porovnána s lokalizací endomembránových markerů ze skupiny Rab a exocytotickým markerem Exo84b. Podjednotky komplexu ARP2/3 lokalizovaly v blízkosti plazmatické membrány do dynamických teček nejvíce se podobajících lokalizaci Exo84b proteinu. Kolokalizační analýza ukázala malou míru kolokalizace signálu Exo84b a ARP2/3 a tento výsledek byl podpořen biochemickým přístupem koimunoprecipitace. Klíčová slova: ARP2/3, endomembránový systém, kortikální vrstva, RabA1g, RabC1, RabD2a, Exo84b,
|
|
|
Regulatory mechanisms of centrosomal microtubule nucleation
Klebanovych, Anastasiya ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
SOUHRN Organizace a dynamika mikrotubulů se mění s ohledem na potřeby buňky při jejím růstu, dělení a diferenciaci, a také při vnitrobuněčném transportu i přenosu signálů. Centrozomální mikrotubuly se tvoří pomocí γ-tubulinových komplexů (γTuRC). Ačkoliv signální dráhy regulující mikrotubulární nukleaci zůstávají do značné míry neznámé, posttranslační modifikace stavebních proteinů γTuRC a jejich interakčních partnerů hrají důležitou úlohu při modulaci nukleace. V předkládané disertační práci jsme funkčně charakterizovali úlohu protein tyrosin fosfatázy SHP-1 a E3 UFM-protein ligázy 1 (UFL1) interagující s proteinem CDK5RAP3 (C53) při regulaci centrozomální mikrotubulární nukleace. Rovněž jsme v tomto procesu objasnili roli profilinu 1, regulačního proteinu aktinových filament. Zjistili jsme, že SHP-1 v žírných buňkách kostní dřeně (BMMC) tvoří komplexy s γTuRC proteiny a inhibuje nukleaci mikrotubulů snížením množství γ-tubulinu/γTuRC v centrozómech. Navrhli jsme nový mechanismus, při kterém aktivní centrozomální Syk kináza, fosforylovaná na tyrosinu a regulovaná SHP-1, moduluje nukleaci mikrotubulů během aktivace BMMC pomocí antigenu. Poprvé jsme ukázali, že proteinový komplex UFL1/C53 se může podílet na regulaci nukleace mikrotubulů. Protein C53, jehož množství je regulováno UFL1, se váže na centrozómy....
|
host ::
RSS.