|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
Izolace DNA z probiotických výrobků s využitím pevných nosičů
Bonczek, Ondřej ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Mikrobiální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk rodu Lactobacillus a z probiotických výrobků. Bylo využito reverzibilní adsorpce DNA na neporézní magnetické částice poly(2-hydroxyethyl methacrylát-co-glycidyl methacrylát) - P(HEMA-co-GMA) pokryté karboxylovými skupinami a nanočástice manganatého Perovskitu, pokrytého silikagelem. DNA byla adsorbována na povrch částic v prostředí 16% PEG 6000 a 2M NaCl. Adsorbovaná DNA byla z částic uvolněna v nízkoiontovém TE pufru (pH= 8,0). Kvalita a koncentrace izolované DNA byla ověřena spektrofotometricky a amplifikací v PCR. Vzorky DNA izolované magnetickými částicemi a metodou fenolové extrakce (kontrola) byly amplifikovány v PCR. DNA izolovaná z hrubých lyzátů buněk probiotických výrobků byla kvantifikována s využitím kvantitativní PCR v reálném čase.
|
|
|
Fluorescenční detekce v analýze patogenů
Tomečková, Kristýna ; Kristýna, Zemánková (oponent) ; Bezděková, Jaroslava (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá izolací a detekcí bakterií a to pomocí metody zvané molekulový imprinting ve spojení s fluorescenční mikroskopií. Teoretická část práce se soustřeďuje na porovnání vyvinutémetody s dosud využívanými metodami. Praktická část byla zaměřena na přípravu a optimalizaci molekulově imprintovaných polymerů na dvou různých nosičích – multititrační destičce a magnetických částicích. Jako otiskovaný templát byla vybrána bakterie Enterococcusfaecalis a její kompetitor bakterie Staphylococcus aureus.
|
|
|
Isolation and detection of DNA from plant species important for food prodution
Orel, Matúš ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
In the food industry, it is very important to take care of the quality, safety and organoleptic properties of the products supplied. For this reason, food must be checked. However, not all information can be found using conventional techniques such as immunoassays, chromatographic techniques, etc. DNA-based techniques can be used for these cases where traditional procedures are insufficient. Among them, the best known technique is PCR. The aim of the thesis was to isolate DNA from vegetable samples (broccoli, beetroot, carrot and pepper). DNA was isolated using the magnetic particle method and the traditional CTAB method. Both methods were able to isolate the DNA from the vegetable samples in quality and at a concentration suitable for PCR, where the 35S rDNA gene region was amplified (more precisely about 700 bp of the 18S-ITS1-5,8S region). After amplification, the PCR products were subjected to restriction reactions and the results compared to bioinformatic analysis. These steps have succeeded in finding suitable enzymes for diferentiation of PCR products from the tested vegetable species.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
|
|
Diagnostika genomem podmíněných onemocnění za využití mikro a nanočástic
Mondeková, Věra ; Prášek, Jan (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Bakalářská práce pojednává o možnostech detekce virového genomu prostřednictvím biosenzorů, konkrétně pomocí magnetických částic. Úvodní část je tvořena stručnou charakteristikou virů, jakožto původců genomem podmíněných onemocnění, na kterou dále navazují kapitoly o vybraných metodách extrakce a analýz nukleových kyselin. Největší část je věnována magnetickým částicím. Praktická část se zabývá možností detekce specifické sekvence virulentního patogenu pomocí biosenzoru, výběrem biokompatibilních molekul vhodných k modifikaci magnetických částic a popisu postupu izolace specifické sekvence DNA pomocí magnetických částic.
|
|
|
Identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení v mléčných výrobcích
Vystavělová, Růžena ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Bakterie mléčného kvašení jsou přirozenou součástí gastrointestinálního traktu člověka. Pro své probiotické účinky jsou často používány do doplňků stravy a pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků. Diplomová práce byla zaměřena na identifikaci vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v sýrech a mléčných výrobcích. Bakteriální DNA byla izolována pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA) z hrubých lyzátů buněk 9 výrobků. Izolovaná DNA byla amplifikována pomocí rodově a druhově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR). Získané amplikony byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Výsledky PCR byly porovnány s údaji uvedenými výrobcem a byla konstatována shoda.
|
|
| |
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem molekulárně biologických metod se zvyšuje zájem o nové postupy izolace DNA o vysoké kvalitě. Izolace DNA se provádí z hrubých lyzátů buněk mnoha technikami např. fenolovou extrakcí, vysolováním nebo adsorpcí na pevnou fázi. Klasická izolace DNA, jakou je fenolová extrakce je poměrně složitá a časově náročná. Z toho důvodu byly vyvinuty nové alternativní metody izolace DNA využívající reverzní imobilizaci DNA na pevnou fázi. Velmi rozšířené je používání magnetických nosičů, které umožňují izolovat DNA ve vysoké kvalitě přímo z hrubých lyzátů buněk komplexních vzorků. Současná metoda adsorpce DNA na povrch magnetických částic neposkytuje v některých případech při analýze komplexních vzorků (např. potravin) dostatečně čistou DNA. Část inhibitorů polymerázové řetězové reakce (PCR) se zřejmě adsorbuje na stěny zkumavky, při eluci DNA dochází k jejich uvolnění do roztoku a následnému ovlivnění kvality DNA (např. snížení citlivosti amplifikace v PCR). Principem vyvíjeného postupu je konstrukce zařízení, které využívá přenos magnetických částic paramagnetickou jehlou z jedné Eppendorfovy zkumavky do druhé, ve které probíhá další zpracování vzorku. Přenosem pomocí jehly se zabraňuje přenosu kontaminujících nečistot. Navržené zařízení umožňuje realizovat výše uvedený postup. Funkčnost zařízení byla ověřena při izolaci plasmidové pUC19 DNA z hrubých lyzátů buněk E. Coli JM 109 (pUC19).
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci DNA z vybraných druhů koření
Gaňová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolácia DNA z rastlinného pletiva v požadovanej kvalite je veľmi komplikovaná, hlavne z dôvodu prítomnosti látok, ktoré môžu interferovať pri amplifikácii DNA. Týmito látkami sú hlavne polyfenoly, polysacharidy, proteíny a rôzne farbivá. Chemická rôznorodosť takýchto látok môže mať významný vplyv na výťažok a kvalitu DNA pri použití jedného izolačného postupu. Hlavným cieľom práce bolo vyhodnotiť použitie mikroizolačného protokolu u príbuzných matríc na kvalitu izolovanej DNA ako aj zhodnotenie vplyvu inhibítorov izolovaných spolu s nukleovou kyselinou na jej amplifikáciu v PCR. DNA bola izolovaná zo sušenej mletej papriky (Capsicum annuum). V prvej fáze boli vzorky homogenizované s použitím lyzačného roztoku s cetyl trimetyl amónium bromidom. Následne bola DNA purifikovaná pomocou reverzibilnej adsorbcie na magnetické nosiče. Celkom bolo testovaných šesť rôzne modifikovaných nosičov. Koncentrácia a čistota získanej DNA bola stanovená spektrofotometricky meraním absorbancie roztoku DNA v TE pufre. Kvalita DNA bola overená amplifikáciou v PCR. Boli použité priméry špecifické pre rastlinnú ribozomálnu DNA (rDNA). Prítomnosť produktov PCR bola dokázaná agarózovou gélovou elektroforézou. Bolo zistené, že použitou mikrometódou je možné izolovať DNA odpovedajúcej čistoty, ktorá je vhodná pre genetickú analýzu pomocou PCR. Boli zistené rozdiely medzi magnetickými nosičmi, ktoré boli testované pre izoláciu DNA.
|
host ::
RSS.