|
|
Využití vybraných fluorescenčních technik k charakterizaci mikrobiálních buněk
Vaněk, Martin ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy patří mezi nejrozšířenější přírodní pigmenty s mnohostranným potenciálem využití. Dlouho upřednostňovaná (levnější) metoda syntetické přípravy v posledních letech dostává stále vážnější konkurenci v podobě zdokonalované biotechnologické produkce. Ke zlevnění biotechnologické produkce může přispět také koncept on-line optimalizace a online analýz. Jednou z metod on-line optimalizace je průtoková cytometrie. V této práci byla zkoumána závislost intenzity autofluorescence kvasničných buněk na koncentraci karotenoidů v biomase a bylo ustanoveno číselné vyjádření těchto závislostí pomocí lineární regrese. Dále byla zkoumána závislost mezi rozptylovými parametry kvasničných buněk a množstvím sušiny ve vzorku. S pomocí modelu, který využívá přímého a bočního rozptylu světla spolu s informací o počtu buněk na jednotku objemu byla nalezena funkční závislost v podobě rovnice přímky. Buňky kvasinek byly zkoumány také pod laserovým skenovacím konfokálním mikroskopem za účelem lokalizace karotenoidů v buňce. Uskutečněné experimenty nasvědčují, že se karotenoidy nacházejí v zásobních lipidických granulích uvnitř buňky, další experimenty jsou však zapotřebí pro jednoznačné prokázání.
|
|
|
The Effect of Synovial Fluid Constituents on Friction and Lubrication of Articular Cartilage
Čípek, Pavel ; Dr. Prashant K. Sharma (oponent) ; Muňoz, Anna Neus Igual (oponent) ; Vrbka, Martin (vedoucí práce)
The present PhD thesis deals with the lubricating mechanism within a model of synovial joint. The aim of this thesis is to describe the effect of individual components of synovial fluid on lubricating film formation in the model of synovial joint; for this purpose, the experimental analysis of friction coefficient and observation of adsorbed lubricating film using the fluorescence microscopy were performed. The special self-designed reciprocating tribometer allowing for simultaneous friction measurement and contact observation was designed. The tribometer was calibrated and verified using a commercial tribometer. Furthermore, the methodology of experiments was developed including a design of evaluation procedure. In order to process the visualization record, the software based on the image segmentation was developed. The last part of the thesis introduces a novel methodological approach together with a new self designed tribometer enabling to assess the role of components contained in the model synovial fluid in relation to the formation of lubricating film based on in situ observation of the contact area and simultaneous frictional measurement. The thesis presents original results extending the knowledge in the natural synovial joint biotribology towards the further development of effective treatment for patients with diseased joints.
|
|
|
Utváření mazacího filmu v poddajném kontaktu
Jaroš, Tomáš ; Čermák, Jan (oponent) ; Nečas, David (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem utváření mazacího filmu v poddajném kontaktu. Primární pozornost je věnována vlivu unášivé rychlosti a stupně prokluzu na centrální tloušťku filmu. Na základě rešeršní studie dostupných experimentálních metod byla pro splnění cílů práce odladěna metoda na principu fluorescenční mikroskopie. Experimenty byly realizovány v konfiguraci ball-on-disk. Nejprve byla provedena validace metody, kdy byl analyzován tuhý kontakt keramické kuličky a skleněného disku. Jelikož se naměřené hodnoty velmi dobře shodovaly s teoretickou predikcí, byla následně využita kulička z pryžového materiálu NBR, který se běžně používá při výrobě břitových těsnění a o-kroužků. Měření byla provedena za čistého valení a různých stupňů prokluzu při uvažování středních rychlostí v rozsahu 10 až 400 mm/s. Bylo aplikováno konstantní zatížení o velikosti 0,2 N. Naměřená data byla následně srovnána s teoretickými predikcemi pro poddajné kontakty. Výsledky ukázaly, že tloušťka mazacího filmu postupně narůstá se vzrůstající střední rychlostí, což odpovídá teoretickému předpokladu. Oproti teorii byl také prokázán zřejmý vliv stupě prokluzu na formování maziva. V závěrečné části práce jsou naměřená data konfrontována s doposud publikovanými vědeckými studiemi, kdy jsou rovněž naznačeny určité limitace této práce a jsou navržena doporučení pro další zpřesnění použité metody.
|
|
|
Analýza bakteriálních buněk pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie
Müllerová, Lucie ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi analýzy viability a obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakteriálních buněk, a to pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V části věnující se cytometrické analýze bakteriálních buněk byla otestována řada viabilních fluorescenčních sond, ale prakticky se osvědčily pouze dva systémy – propidium iodid a komerční BacLightTM kit, který vykazoval o něco vyšší přesnost stanovení viabilitně bakteriální kultury. Dále byla využita akridinová oranž k analýze fyziologického stavu mikrobiální kultury a dvě hydrofobní sondy, Nilská červeň a BODIPY 493/503, k analýze obsahu PHA v bakteriálních buňkách. Především sonda BODIPY 493/505 se zdá být velmi zajímavá, protože nevyžaduje permeabilizaci buněčných obalů a díky svým spektrálním vlastnostem je plně kompatibilní s propidium iodidem. Tato skutečnost otevírá možnost simultánní analýzy viability bakteriálních kultur a obsahu PHA. V části vyhodnocování mikroskopických výsledků bylo prezentováno několik fluoroforů. Bylo zjištěno, že koncentrace fluoroforů využívaná pro cytometrické analýzy je pro mikroskopii příliš vysoká. SYTO9 svítící převážně v zeleném kanále měla určitý fluorescenční signál i v červeném kanále. Vzorky obarvené BODIPY 493/503 vykazovaly vysoké intenzity fluorescence při koncentraci barviva 10 . Zároveň byly jak u obou kmenů naměřeny záporné amplitudy intenzity fluorescence, výraznější byla u C. necator H16. U tohoto kmene byl překvapivý objev vysoké koncentrace barviva především na povrchu granulí PHB, kde byla zároveň téměř nulová anisotropie barviva (volná otáčivost sondy).
|
|
|
Cytotoxicita vybraných naftochinonů na prostatických buněčných liniích
Mondeková, Věra ; Gumulec, Jaromír (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Tato diplomová práce pojednává o cytotoxicitě vybraných naftochinonů na prostatických buněčných liniích. Úvodní část je věnována obecné charakteristice naftochinonů se zaměřením na jejich cytotoxicitu, testování a mechanismy cytotoxicity. Dále navazují kapitoly o cytotoxicitě, charakteristice a hlavně biologické aktivitě vybraných naftochinonů plumbaginu a naftazarinu. Poslední část teoretického oddílu je věnována fluorescenční mikroskopii a jejímu vyuţití při zkoumání cytotoxicity naftochinonů. Praktická část této práce se zabývá vyhodnocením výsledků cytotoxických testů a analýzou snímků buněk linií PC3 a PNT1A získaných pomocí fluorescenční mikroskopie. V závěru práce jsou všechny poznatky shrnuty a dány do souvislosti.
|
|
|
Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator
Marková, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá autofluorescencí flavinů v gram-negativní bakterii Cupriavidus necator H16 a jejím mutantním kmenu PHB-4. Experimenty byly prováděny pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pro potvrzení přítomnosti flavinů byla změřena excitační a emisní spektra bakteriální suspenze, která se porovnala s flavinovými standardy. V části věnované testování buněk bez stresové odpovědi se měřila autofluorescence bakterií v PBS pufru a buněčné suspenze obarvené fluorescenční sondou BODIPY 493/503. Byl porovnáván poměr krátké doby života ku dlouhé době života autofluorescence a jeho závislost na přítomnosti fluorescenční sondy. Dále byla měřena autofluorescence supernatantu, kdy bylo zjištěno, že relativní zastoupení dlouhé doby života v extracelulárním prostředí je mnohonásobně vyšší než v intracelulárním. V části věnované stresové odpovědi se práce zaměřila na množství rozpuštěného kyslíku v produkčním médiu. Dále byl použit různě koncentrovaný peroxid vodíku, kdy nejlepší výsledky vykazovala koncentrace 100 mM. Pro porovnání s předchozími podmínkami se využila kombinace se síranem železnato-amonným, kde ale nebyl pozorován žádný rozdíl. Z látek ovlivňujících přímo dýchací řetězec byl použit azid sodný a antimycin A. Obě tyto látky měly vliv na změnu poměru relativního zastoupení dob života autofluorescence, ovšem rozložení těchto dob života a změnu rozložení autofluorescence v průběhu času ovlivňoval pouze azid sodný.
|
|
|
Aflatoxiny v potravinách a jejich vliv na DNA a buněčné linie
Šislerová, Lucie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Aflatoxiny představují kvůli jejich vysoké toxicitě a karcinogenitě velké nebezpečí, kterému se v běžném životě snadno nevyhneme. Intoxikace aflatoxiny způsobuje velkou řadu onemocnění od těch lehčích až po nekrózu orgánů či smrt. Nejvíce aflatoxiny postihují játra, kde dochází k jejich odbourávání a vzniku následných metabolitů, které jsou pro tělo nejtoxičtější. Z tohoto důvodu je jejich přesné stanovení a porozumění principu jejich účinků velmi důležité. V práci byly kalibrovány metody pro sledování a k bližšímu určení vlivu aflatoxinů na lidské buňky. K tomuto sledování byly použity metody: MTT testy viability, fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie. Jako další bylo proměřeno množství přítomných aflatoxinů v různých potravinách s odlišnými podmínkami skladování. Pro tuto analýzu byly použity ELISA testy RIDASCREEN Aflatoxin Total a RIDA Aflatoxin column. Kalibrované metody byly porovnány s metodami již používanými pro stanovení vlivu aflatoxinů a výsledky ELISA testů byly porovnány s limity množství aflatoxinů povolenými Českou legislativou. Žádná z kontrolovaných potravin neobsahovala nadlimitní koncentraci aflatoxinů, která je v České republice stanovena na 4-10 µg/l (liší se pro různé druhy potravin). Nejvyšší hodnoty aflatoxinů vykazovaly potraviny, které byly špatně skladovány ale nebyly viditelně napadeny plísněmi. Byla stanovena hodnota LD50 pro aflatoxin B1 na 12,25 µM. Pomocí průtokové cytometrie byl stanoven druh buněčné smrti, kterou aflatoxin způsobil a tato data byla dále potvrzena díky snímkům z fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Analýza mazaného kontaktu poddajných těles
Dočkal, Kryštof ; Dzimko, Marián (oponent) ; Nečas, David (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá návrhem metodiky hodnocení tloušťky filmu maziva v poddajných kontaktech. S ohledem na charakteristiky těchto kontakt- ních dvojic, jako je například variabilita tlouštěk filmu, vysoká drsnost povrchů, či špatná vodivost a odrazivost, je využití konvenčních metod značně kompliko- vané. V práci je použita optická měřicí metoda na principu fluorescenční mikro- skopie. V rámci práce byl vytvořen algoritmus, zahrnující normalizaci k pozadí a kalibraci intenzity fluorescence na tloušťku maziva v kontaktu, který je zpraco- ván ve formě experimentálního softwaru. Algoritmus byl verifikován s využitím elastohydrodynamického kontaktu tvořeného keramickou kuličkou a skleněným diskem. Naměřené výsledky byly porovnány s teoretickou predikcí, přičemž byla zaznamenána velmi dobrá shoda získaných dat. Následně byla realizována série měření s poddajnými vzorky, přičemž byla hodnocena závislost centrální tlou- šťky filmu v závislosti na střední rychlosti, použitém mazivu, velikosti zatížení a skluzově-valivém poměru. Závěrečná část práce se zabývá analýzou výsledků a jejich diskusí s ohledem na dosud publikovanou literaturu.
|
|
|
Konstrukce testovacího zařízení pro pozorování distribuce maziva ve valivém ložisku
Okál, Michal ; Hartl, Martin (oponent) ; Košťál, David (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá návrhem a realizací zařízení, jehož účelem je vytvoření reálných podmínek v oblasti kontaktu valivého ložiska a následné přímé pozorování této oblasti. Úvodem je práce zaměřena na popis fungování valivého ložiska, procesy tření a opotřebení během provozu. Následně jsou v práci popsána zařízení, která jsou ve světě využívána pro studium procesu mazání uvnitř valivého ložiska. Poté následuje vlastní řešení autora, kde výsledkem je zařízení konfigurace Ball-on-ring vytvářející geometrické, rychlostní a tlakové podmínky, identické s podmínkami ve skutečném valivém ložisku. Distribuce maziva v okolí kontaktu je analyzována optickou metodou fluorescenční mikroskopie. Součásti práce je ověřovací experiment a kompletní výkresová dokumentace zařízení.
|
|
|
Fytotoxicita vybraných naftochinonů na vybraném rostlinném modelu
Rucký, Jakub ; Masařík,, Michal (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Úvodní část mé diplomové práce je zaměřena na teoretický rozbor řešené problematiky, jako je zkoumání toxicity naftochinonů plumbagin a juglon a to především s ohledem na jejich alelopatické působení. Další část se zaměřuje na stres rostlin, vyvolaný působením stresových faktorů, vedoucí až k jejich úhynu. Je zde rozebrán experimentální protokol a možnosti stanovení vlivu naftochinonů na rostlinný model. Experimentální část pojednává o měnících se růstových parametrech rostlinných vzorků, v závislosti na různých koncentracích naftochinonu. Je zkoumána životaschopnost buněk a změny v syntéze sekundárních metabolitů. Data získaná pomocí spektrofotometrické a mikroskopické analýzy jsou vyhodnocena pomocí softwaru STATISTICA a statistické významnosti jsou vyneseny do grafů.
|
host ::
RSS.