|
|
Studium zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi mikroorganismů
Kučera, Dan ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem práce bylo studium zapojení polyhydroxyalkonoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií. Teoretická část bakalářské práce se zabývá možností stanovení viability mikroorganismů s využitím moderních technik, především průtokové cytometrie. Dále pak byla zpracována rešerše zaměřená na vybrané stresové faktory a zapojení PHA do stresové odpovědi. V experimentální části práce byla posuzována stresová odpověď v souvislosti se schopností akumulovat PHA. Tomuto experimentu posloužila bakterie Cupravidus necator. Schopnost akumulace PHA v pozdější fázi růstové křivky navyšuje odolnost vůči ethanolu, vysoké teplotě a mražení. Naopak nižší odolnost jevil kmen produkující PHA při působení anorganickými kyselinami a zásadami. Důvodem může být odlišná morfologie PHA produkujících buněk. Dílčím cílem bylo i studium možnosti barvení živých buněk akumulujících PHA pomocí Nilské červeně. Studium ukázalo, že barvivo penetruje do živých buněk při teplotě zvýšené na 40-45 °C. Tato teplota není pro buňky letální a intenzita barvení je dostatečná k odlišení PHA produkujících buněk pomocí průtokové cytometrie, což může mít využití při selekci průmyslových producentů PHA.
|
|
|
Testování možností enkapsulace vybraných druhů makromolekul a bakterií
Kapar, Jiří ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na testování možností enkapsulace enzymů a probiotických bakterií. V teoretické části jsou shrnuty enkapsulační techniky používané v potravinářském průmyslu. Dále jsou popsány materiály pro enkapsulaci, především polysacharidové povahy. V dalších kapitolách teoretické části jsou diskutovány některé postupy enkapsulace biopolymerů a mikroorganismů se zaměřením na enzymy a probiotické kultury. V experimentální části jsou uvedeny postupy přípravy řady typů částic na bázi polysacharidů a liposomů. Částice byly použity pro enkapsulaci vybraných hydrolytických enzymů a probiotických kmenů Bifidobacterium breve a Lactobacillus acidophilus. Mezi skupinové parametry pro posouzení enkapsulační účinnosti enzymů bylo zařazeno stanovení bílkovin a enzymové aktivity. Dále byla sledována velikost částic a jejich stabilita ve vodném prostředí, ve vybraných modelových potravinách a v modelových tělních tekutinách. V práci bylo zjištěno, že enkapsulace enzymů do polysacharidových částic byla účinná téměř u všech typů částic více než z 50 %. Polysacharidové částice vykazovaly velmi dobrou stabilitu v tělních tekutinách i v modelových potravinách. Jako nejvhodnější částice pro enkapsulaci enzymů se osvědčily chitosanové částice a liposomy. Při enkapsulaci mikroorganismů byly použity polysacharidové částice, stabilita těchto částic byla podobná jako u částic použitých k enkapsulaci enzymů. Částice s mikroorganismy vykazovaly rovněž velmi dobrou stabilitu v modelových potravinách i v modelových tělních tekutinách. Enkapsulace umožňuje dlouhodobou stabilizaci biologicky aktivních látek a možnost jejich transportu a řízeného uvolnění v trávicí soustavě. Enkapsulace probiotických mikroorganismů umožňuje udržení jejich viability po dobu expirace produktu. Enkapsulace je tedy jednou z perspektivních metod pro produkci kvalitních potravin a potravinových doplňků s vysokou přidanou hodnotou.
|
|
|
Utilization of physicochemical and spectroscopic techniques in study of stress-response of cyanobacteria
Skoryk, Maksym ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor's thesis focuses on observation of cyanobacteria exposed to osmotic-up and down stresses. Based on literature review appropriate methods have been proposed to study two model organisms - Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis sp. salina Wislouch CCALA 192. Four methods have been utilized to characterize osmotically stressed cyanobacteria. Flow cytometry has been utilized to assess viability of bacteria. SYTOX Blue fluorescent stain provided reliable information on bacteria stress resistance, whilst when stained with propidium iodide obscured results were obtained. Optical properties of cyanobacteria have been characterized with UV-VIS absorbance and turbidity measurements. Bacteria have undergone thermogravimetric analysis upon stress exposure to estimate cell volume dependence on extent of salt stress. This analysis suggested that PHB-positive Synechocystis sp. PCC 6803 tend to be more endurable to osmotic up-stress than PHB-negative. Gas chromatography showed PHB-positive cells to contain 1-2 % of PHB per dry cell mass.
|
|
|
Study on potential applications of glutamic acid polymer
Čangelová, Katarína ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The subject of the thesis is study of possible applications of isoform of glutamic acid polymer (-PGA). The theoretical part is focused on the properties of this biopolymer and potential applications in various areas. Producers and mechanisms of biosynthesis are also mentioned. In the experimental part, the polymer was firstly characterised by following methods: FT-IR spectroscopy, TGA, DSC and SEC-MALS. Its isoelectric point, antimicrobial activity and solubility in various solvents were also determined. The biopolymer was also precipitated by divalent cations and its interaction with oppositely charged CTAB surfactant was studied. The main experimental study was researching the effect of -PGA on viability of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus rhamnosus under stress conditions by flow cytometry. The performed stresses included ethanol exposure, high temperature and freezing stress, in which its effects were compared to conventional cryoprotectants. The cells of the mentioned microorganisms were also stressed osmotically and exposed to model gastrointestinal juices - gastric, pancreatic and bile. The protective effects of -PGA on the cells were recorded in ethanol stress on Lactobacillus rhamnosus. Its excellent cryoprotection properties were confirmed and its protective effect of gastric juice exposure on Saccharomyces cerevisiae cells was also observed. At the end of the experimental part, -PGA/alginate beads suitable for encapsulation of probiotic bacteria and -PGA/chitosan nanoparticles for encapsulation of biologically active substances.
|
|
|
Stresová odolnost PHA akumulujících bakterií vůči podmínkám v gastrointestinálním traktu
Kovářová, Radka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen.
|
|
|
Stresová odolnost bakteriálních monokultur a směsných kultur
Chorvátová, Michaela ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
V tejto bakalárskej práci bola skúmaná stresová odolnosť bakteriálnych monokultúr a definovanej zmiešanej kultúry. Teoretickú časť predstavuje literárna rešerš, ktorá sa zaoberá všeobecnou stresovou odolnosťou baktérií a dynamikou ich rastu. Ďalej sú predstavené polyhydroxyalkanoáty, ich zapojenie do stresovej odpovede baktérií a významná moderná metóda akou je prietoková cytometria, ktorá predstavovala dôležitú súčasť experimentu. V experimentálnej časti bola študovaná odolnosť voči osmotickému a teplotnému stresu. Pre tento účel boli použité monokultúry PHA akumulujúceho kmeňa Cupriavidus necator H16 a mutantného kmeňa Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopného akumulácie PHA. Definovaná zmiešaná kultúra bola pripravená kokultiváciou týchto dvoch kmeňov. Celkovo možno konštatovať, že akumulácia a utilizácia PHA, konkrétne poly(3-hydroxybutyrátu), zvýšila odolnosť baktérií, čo sa najviac prejavilo u osmotického stresu, kedy koncentrácie soli nespôsobili výraznejšie zníženie viability u Cupriavidus necator H16 oproti mutantnému kmeňu, ktorého viabilita klesala s rastúcou intenzitou stresu. Experimentálne teploty naopak nepredstavovali výrazný vplyv na viabilitu buniek, pričom sa takmer vždy potvrdilo, že baktériám sa najviac darilo pri ich teplotnom optime 30 °C.
|
|
|
Využití vybraných fluorescenčních technik k charakterizaci mikrobiálních buněk
Vaněk, Martin ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy patří mezi nejrozšířenější přírodní pigmenty s mnohostranným potenciálem využití. Dlouho upřednostňovaná (levnější) metoda syntetické přípravy v posledních letech dostává stále vážnější konkurenci v podobě zdokonalované biotechnologické produkce. Ke zlevnění biotechnologické produkce může přispět také koncept on-line optimalizace a online analýz. Jednou z metod on-line optimalizace je průtoková cytometrie. V této práci byla zkoumána závislost intenzity autofluorescence kvasničných buněk na koncentraci karotenoidů v biomase a bylo ustanoveno číselné vyjádření těchto závislostí pomocí lineární regrese. Dále byla zkoumána závislost mezi rozptylovými parametry kvasničných buněk a množstvím sušiny ve vzorku. S pomocí modelu, který využívá přímého a bočního rozptylu světla spolu s informací o počtu buněk na jednotku objemu byla nalezena funkční závislost v podobě rovnice přímky. Buňky kvasinek byly zkoumány také pod laserovým skenovacím konfokálním mikroskopem za účelem lokalizace karotenoidů v buňce. Uskutečněné experimenty nasvědčují, že se karotenoidy nacházejí v zásobních lipidických granulích uvnitř buňky, další experimenty jsou však zapotřebí pro jednoznačné prokázání.
|
|
|
Analýza bakteriálních buněk pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie
Müllerová, Lucie ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi analýzy viability a obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakteriálních buněk, a to pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V části věnující se cytometrické analýze bakteriálních buněk byla otestována řada viabilních fluorescenčních sond, ale prakticky se osvědčily pouze dva systémy – propidium iodid a komerční BacLightTM kit, který vykazoval o něco vyšší přesnost stanovení viabilitně bakteriální kultury. Dále byla využita akridinová oranž k analýze fyziologického stavu mikrobiální kultury a dvě hydrofobní sondy, Nilská červeň a BODIPY 493/503, k analýze obsahu PHA v bakteriálních buňkách. Především sonda BODIPY 493/505 se zdá být velmi zajímavá, protože nevyžaduje permeabilizaci buněčných obalů a díky svým spektrálním vlastnostem je plně kompatibilní s propidium iodidem. Tato skutečnost otevírá možnost simultánní analýzy viability bakteriálních kultur a obsahu PHA. V části vyhodnocování mikroskopických výsledků bylo prezentováno několik fluoroforů. Bylo zjištěno, že koncentrace fluoroforů využívaná pro cytometrické analýzy je pro mikroskopii příliš vysoká. SYTO9 svítící převážně v zeleném kanále měla určitý fluorescenční signál i v červeném kanále. Vzorky obarvené BODIPY 493/503 vykazovaly vysoké intenzity fluorescence při koncentraci barviva 10 . Zároveň byly jak u obou kmenů naměřeny záporné amplitudy intenzity fluorescence, výraznější byla u C. necator H16. U tohoto kmene byl překvapivý objev vysoké koncentrace barviva především na povrchu granulí PHB, kde byla zároveň téměř nulová anisotropie barviva (volná otáčivost sondy).
|
|
|
Mechanismus plastifikace polyhydroxyalkonátů v mikrobiálních buňkách – inspirace pro vývoj artificiálních nosičových systémů
Liczka, Jan ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce je zaměřena na studium mechanismu plastifikace polyhydroxyalkanoátů (PHA) in vivo, přičemž se soustředí především na metody izolace nativních PHA granulí a fyzikální, resp. chemické metody iniciace jejich fázových přechodů. V práci zpracovaná Literární rešerše pojednává o tomto mikrobiálním polyesteru a dále se zaměřuje na jednotlivé metody izolace PHA z bakteriálních buněk. Hlavní náplní experimentální práce byla optimalizace postupu izolace nativních PHA granulí, a dále návrh a testování postupů, které iniciují krystalizaci PHA v izolovaných granulích, a také analytických postupů, jak tento fázový přechod korektně detekovat. Izolace PHA granulí z bakterií Cupriavidus necator se prováděla pomocí enzymů, několikanásobného odstředění a rozrušením buněk ultrazvukem. K detekci krystalizace PHA se používala infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) a enzymatická metoda, při níž je amorfní PHA selektivně degradováno PHA-depolymerázou s turbidimetrickou detekcí jeho úbytku v disperzi. V rámci podrobnějšího studia mechanismu plastifikace PHA v granulích byly využity techniky založené na fluorescenčním barvení granulí (fluorescenční spektroskopie a průtoková cytometrie). Výsledky provedených analýz mimo jiné potvrdily, že optimalizovaným postupem je možné izolovat granule v amorfním stavu, které zůstávají amorfní i po vysušení a jsou svými základními fyzikálně-chemickými vlastnostmi srovnatelné s nativními granulemi.
|
|
|
Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator
Marková, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá autofluorescencí flavinů v gram-negativní bakterii Cupriavidus necator H16 a jejím mutantním kmenu PHB-4. Experimenty byly prováděny pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pro potvrzení přítomnosti flavinů byla změřena excitační a emisní spektra bakteriální suspenze, která se porovnala s flavinovými standardy. V části věnované testování buněk bez stresové odpovědi se měřila autofluorescence bakterií v PBS pufru a buněčné suspenze obarvené fluorescenční sondou BODIPY 493/503. Byl porovnáván poměr krátké doby života ku dlouhé době života autofluorescence a jeho závislost na přítomnosti fluorescenční sondy. Dále byla měřena autofluorescence supernatantu, kdy bylo zjištěno, že relativní zastoupení dlouhé doby života v extracelulárním prostředí je mnohonásobně vyšší než v intracelulárním. V části věnované stresové odpovědi se práce zaměřila na množství rozpuštěného kyslíku v produkčním médiu. Dále byl použit různě koncentrovaný peroxid vodíku, kdy nejlepší výsledky vykazovala koncentrace 100 mM. Pro porovnání s předchozími podmínkami se využila kombinace se síranem železnato-amonným, kde ale nebyl pozorován žádný rozdíl. Z látek ovlivňujících přímo dýchací řetězec byl použit azid sodný a antimycin A. Obě tyto látky měly vliv na změnu poměru relativního zastoupení dob života autofluorescence, ovšem rozložení těchto dob života a změnu rozložení autofluorescence v průběhu času ovlivňoval pouze azid sodný.
|
host ::
RSS.