|
|
Linking Proteomes to Phenotypic Traits
Jelínek, Tomáš ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Proteiny, jakožto hlavní aktéři v buněčných procesech, mají zásadní roli ve formování fenotypových znaků. Tato práce zkoumá aplikaci proteomic- kých dat, získaných pomocí LC-MS/MS, pro pochopení vztahů mezi expresí proteinů a výslednými fenotypy. Diskutuje různé bioinformatické postupy, od předzpracování dat po techniky normalizace a metod imputace chybě- jících hodnot, pro zajištění co nejvyšší kvality dat pro následující analýzy. Dále tato práce popisuje, jak lze získat vhled do oněch fenotypových znaků u různých druhů zvířat či patologických stavů za užití analýzy diferenciální exprese, evolučního modelování pomocí Ornstein-Uhlenbeckova procesu nebo algoritmů strojového učení.
|
|
|
Studium struktury a interakcí proteinů pomocí strukturní hmotnostní spektrometrie
Portašiková, Jasmína Mária ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Transmembránové kanály a přenášeče z ClC proteinové rodiny se vyskytují napříč všemi živými organismy. Nacházejí se na cytoplasmatických a lysosomálních membránách buněk, kde se podílí na udržování homeostázy iontů. Narušení jejich funkce vede k vážným zdravotním komplikacím. Pro vývoj efektivní léčby těchto onemocnění je potřeba objasnit transportní mechanismus ClC proteinů. Antiporter ClC-ec1 z E.coli je modelovým proteinem celé ClC proteinové rodiny. Tento homodimerní protein, který transportuje proton proti dvěma chloridovým iontům, má transportní dráhu v každé z podjednotek. Na základě krystalové struktury se přepokládá, že během transportu se protein střídavě otevírá na obě strany membrány. Otevření proteinu směrem ven je umožněno protonací tří glutamátů, které se nacházejí v transportní dráze a jsou pro transport iontů klíčové. Pro studium tohoto stavu byl navržen QQQ mutant, který má tyto glutamáty nahrazeny za glutaminy. Dosud se studium transportního mechanismu ClC-ec1 opíralo převážně o studie založené na rentgenové krystalografii. Krystalografie poskytla statické obrázky, které neobsahovaly dostatečné informace o dynamice proteinu. Proto jsme pro studium transportního mechanismu ClC-ec1 zvolili dynamickou metodu - vodík-deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií. Součástí...
|
|
|
Utilization of pulse labelling techniques for studying the dynamics of proteins and protein complexes
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
(In Czech) Hmotnostní spektrometrie (MS) se stala častou technikou pro sledování struktury a dynamiky proteinů a proteinových komplexů. I když techniky založené na MS detekci nemohou poskytovat informace s vysokým rozlišením, jako je např. rentgenová difrakce, nukleární magnetická rezonance (NMR), nebo kryo-elektronová mikroskopie (cryo-EM), jsou dobrým nástrojem z hlediska poskytování informaci ohledně dynamiky, struktury a interakcí analytů s dalšími molekulami, např. ligandy. Tato doktorská práce představuje přínos do oblasti strukturní biologie při využití kovalentního značení, tzv. rychlé fotochemické oxidace proteinů (FPOP) a oxidace singletním kyslíkem (1 O2) pro studium struktury, dynamiky a interakcí proteinů a proteinových komplexů s dvoušroubovici DNA.V první části práce byla metoda FPOP využita k studiu struktury komplexu FOXO4-DAF16, která poukázala na možnosti analýzy takového komplexu pomocí přístupů "bottom-up" a "top-down". Dále je zde představena strategie izotopové deplece pro strategii "top- down", kde je demonstrována její výhoda ve spojení s multiCASI-ECD za účelem získaní nejvyšší možné strukturní informace ohledně interakce FOXO4 s IRE. Studie ukazuje, jak mohou informace získané ze strukturní proteomiky vést k vytvoření in-silico modelů protein-DNA komplexů, jejichž...
|
|
|
Sexual promiscuity, cryptic female choice and the biology of passerine sperm
Míčková, Kristýna ; Albrecht, Tomáš (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent) ; Krist, Miloš (oponent)
Objev postkopulačních mechanizmů výběru partnera zásadně změnil pohled na pohlavní selekci. Pěvci tvoří ideální skupinu pro studium dvou mechanizmů postkopulační pohlavní selekce, kompetice spermií a skryté volby samice. Tato dizertační práce se zabývá postkopulační selekcí ze třech různých uhlů právě u tohoto taxonu. V této práci jsme se zabývali (1) životními změnami znaků, které mohou ovlivňovat reprodukční úspěch samců (morfologie a velocita spermií, produkce spermií) a zároveň trade-off mezi těmito znaky a délkou dožití u samců vlaštovky obecné (Hirundo rustica); (2) variabilitou v proteinech seminální tekutiny a spermií u šesti vybraných druhů pěvců a zda jsou tyto rozdíly způsobeny fylogenezí či vlivem postkopulační pohlavní selekce a (3) popisem proteinového složení samičích kloakálních tekutin vlaštovky obecné ve čtyřech fázích reprodukčního cyklu, změnami v zastoupení proteinů v jednotlivých fázích a stanovením proteinů specifických pro jednotlivé reprodukční fáze. Naše výsledky ukazují, že neexistuje jednotný trend pro změny ve znacích spermií či produkce spermií napříč životem samce. Zatímco morfologie ani velocita spermií se zásadně nemění, produkce spermií v prvních letech života stoupá. Přílišná investice do produkce spermií však může snížit šance samce na delší život, což...
|
|
|
Proteomic architecture of sperm-egg interactions
Otčenášková, Tereza ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Nedávné pokroky v proteomických metodách poskytují nové poznatky pro biologický výzkum a to včetně oblasti reprodukční biologie. Stanovení proteomického základu spermií je klíčové pro pochopení komplexního procesu interakcí gamet během oplození zahrnující akrozomální reakci. Napříč živočišnými taxony lze pozorovat značné rozdíly ve velikosti, tvaru a molekulárním složení spermií způsobené postkopulačním pohlavním výběrem a fylogenezí. První cílem této disertační práce je characterizovat proteinové složení akrozomu a zjistit tak jeho další funkční význam v interakci spermie a vajíčka. Dále se zaměřujeme na možné souvislosti mezi proteinovým složením spermií a morfologickou diverzifikací spermií, mírou výskytu kompetice spermií a fylogenetickou příbuzností zkoumaných druhů. Pro analýzy byli použiti samci odchycení v přírodě z přirozených populací druhů Mus musculus musculus, Apodemus flavicollis, Microtus arvalis (řád Hlodavci), Acrocephalus palustris, Chloris chloris, Phylloscopus collybita, Cinclus cinclus, Hirundo rustica a Taeniopygia guttata chovaní v zajetí (řád Pěvci). Jako hlavní metodologický přístup byla v celé práci použita nano kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Naše data ukazují, že biologické role akrozomu hlodavců nespočívají pouze v usnadňování...
|
|
|
Proteomika pro začátečníky
Hubálek, Martin ; Vrbacký, M. ; Křenková, Alena
Náplní kurzu bude úvod do proteomiky s cílem ukázat současné metody a nástroje použitelné k akvizici a vyhodnocení proteomických dat. Ve dvou na sebe navazujících částech kurzu budeme\nklást důraz na interpretaci proteomických spekter, pochopení principů identifikace peptidů a proteinů a kvantifikační postupy. Na praktických příkladech vysvětlíme De-novo sekvenaci peptidů a použití volně dostupných programů MaxQuant a Perseus na identifikaci, kvantifikaci a vizualizaci dat.
|
|
| |
|
|
Functional characterisation of new components of mitochondrial proteome.
Kovalčíková, Jana ; Vrbacký, Marek (vedoucí práce) ; Červinková, Zuzana (oponent) ; Ješina, Pavel (oponent)
1 Abstrakt Mitochondriální proteom savců je tvořen ~1500 různými proteiny, z nichž není stále přibližně jedna čtvrtina plně charakterizována. Jedním z těchto proteinů je TMEM70 podílející se na biogenezi eukaryotické F1Fo-ATP syntázy. Mutace v TMEM70 způsobují izolovaný nedostatek ATP syntázy, což často vede u pacientů k letálním neonatálním mitochondriálním encefalokardiomyopatiím. Abychom porozuměli molekulárnímu mechanismu působení TMEM70, vytvořili jsme konstitutivní Tmem70 knockout myší model, který byl embryonálně letální s narušenou biogenesí ATP syntázy. Následně vytvořený myší indukovatelný Tmem70 knockout model byl letální v 8. týdnu po indukci. Především vykazoval funkční poruchu jater, což je v kontrastu k převážně kardiologickému fenotypu u lidí v počátku onemocnění. Analýza jaterních mitochondrií odhalila tvorbu labilních subkomplexů ATP syntázy postrádajících podjednotku c. V případě deficitu TMEM70 tedy nebyl inkorporován c-oligomer do ATP syntázy, což vedlo ke kritickému poškození produkce energie mitochondriemi, analogickému k dysfunkci TMEM70 u lidí. V modelech s deficitem TMEM70 dosáhl nedostatek ATP syntázy limitu pro jeho patologický projev, který jsme stanovili na 30 %. Pozorovali jsme také kompenzační zvýšení obsahu většiny komplexů OXPHOS, ale neočekávaně také ANT a PiC, komponent...
|
|
|
Příprava rekombinantních extracelulárních domén lidských leukocytárních receptorů LLT1 a NKR-P1A
Vostárek, František ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
NK buňky jsou charakterizovány jako velké granulární lymfocyty, které patří mezi významné buněčné složky přirozené imunity. Dokáží zabíjet cílové buňky velmi rychle, v řádech minut, což je řadí do role obránců první linie. Své cíle rozpoznávají pomocí svých povrchových receptorů. Tato práce se zabývá přípravou extracelulárních domén lidských leukocytárních receptorů hNKR-P1A a jeho fyziologického ligandu LLT1. Proteiny byly produkovány v E. coli ve formě inkluzních tělísek a renaturovány in vitro metodou rychlého naředění (hNKR-P1A) a metodou pomalého naředění (LLT1). Purifikace probíhala pomocí chromatografických metod a získané proteiny byly charakterizovány technikami hmotnostní spektrometrie.
|
|
|
The role of NADPH oxidase and ros in invadopodia formation
Hanušová, Kristýna ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Invadopodia, jako specifické organely nádorových buněk umožňující jim pohyb a tudíž i šíření po organismu a tvorbu metastáz, jsou jedním z možných slibných cílů pro nádorovou terapii. V poslední době vyšly na jevo mnohé zajímavé skutečnosti o vzniku invadopodií a mechanismu jejich fungování. Invadopodia jsou místy degradace ECM extracelulárními proteázami umožňující invazivitu nádorových buněk. Pro vznik invadopodií je nezbytná přesně lokalizovaná zvýšená tvorba reaktivních kyslíkových radikálů, které se jako důležité signální molekuly účastní mnoha dějů vedoucích k tvorbě invadopodií. ROS v nádorových buňkách jsou produkovány především specifickými extramitochondriálními NADPH oxidázami (Nox). V poslední době bylo odhaleno několik regulačních molekul, které se podílí na vzniku těchto Nox a jejich lokalizaci do místa vzniku invadopodií (Tks organizační proteiny). Dále byla v produkci ROS a následném vzniku invadopodií potvrzena regulační role kinázy Src. Klíčová slova: degradace ECM, invadopodia, invaze, proteázy, Nox, ROS, Src kináza, Tks proteiny
|
host ::
RSS.