|
|
Mechanisms of membrane protein quality control in the endoplasmic reticulum
Jirout, Matěj ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Integrální membránové proteiny (IMP) procházejí rozsáhlou kontrolou kvality (QC) v endoplazmatickém retikulu (ER), aby se udržela proteostáza a integrita proteomu ER. Ribosomální kontrola kvality proteinů asociovaná s ER (ER-ribosome-associated protein quality control; ER-RQC) reaguje na zastavení ribozomů během translokace a pomáhá uvolnit ucpaný translokon. Degradace proteinů asociovaná s ER (ER-associated degradation; ERAD) cílí špatně sbalené IMP k proteasomální degradaci. IMP odolné vůči ERAD jsou degradovány pomocí různých ER-fagických drah, souhrně označovaných jako ELRAD (ER-to-lysosome associated degradation). Koordinaci těchto mechanismů zajišťuje odpověď na špatně sbalené proteiny (unfolded protein response, UPR), ačkoli receptory UPR nejsou s největší pravděpodobností aktivovány aberantními IMP, protože všechny tyto mechanismy fungují i jako mechanismy kontroly kvality ER-luminárních proteinů.
|
|
|
Structural insights into innate immune evasion mechanisms of African trypanosomes and type C adenoviruses
Sülzen, Hagen ; Zoll, Sebastian (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Šilhán, Jan (oponent)
Lidské tělo si vyvinulo množství složitých obranných mechanismů, kterými se brání všem potenciálně patogenním mikroorganismům, které jsou nuceny vyvíjet příslušná protiopatření. Podrobné znalosti strukturální podstaty mechanismů obcházení imunitního systému lidskými infekčními patogeny, mají zásadní význam pro vývoj účinných léků a terapií. V této práci je na příkladu invariantního povrchového glykoproteinu 65 (ISG65) z krevní formy lidského infekčního parazita Trypanosoma brucei gambiense (Tbg) představen protokol pro zlepšení rekombinantní exprese proteinů s komplexním složením a pro vytvoření minimálního konstruktu vhodného pro strukturní charakterizaci. Kromě toho zde uvedené poznatky odhalují biologickou funkci ISG65 jako receptoru pro složku lidského komplementu C3b, popisují jeho úlohu jako selektivního inhibitoru alternativní cesty komplementového systému a představují první struktury TbgISG65 v komplexu s lidským C3 a C3b. K objasnění toho, jak mohou další invariantní povrchové receptory parazita vykonávat svou funkci v rámci ochranného štítu tvořeného okolními variantními povrchovými glykoproteiny (VSGs), byla hodnocena konformační flexibilita povrchového pláště parazita v krevním řečišti. Zatímco infekce africkými trypanosomami má pro zdraví pacienta závažné následky, infekce rozšířeným...
|
|
|
Odhalení molekulárních mechanismů opravy abazického meziřetězcového spojení DNA
Hušková, Andrea ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
3 Abstrakt DNA jako primární nositelka genetické informace zaručuje organismům žít, růst, rozvíjet se a množit. Tato nejpodstatnější molekula v buňce však podléhá každou chvíli rozličným poškozením. Pokud není opraveno, buňka a organismus nakonec podlehne nevyhnutelné destrukci. Jedno z nejzávažnějších poškození je meziřetězcové kovalentní spojení DNA vycházející z abazického místa (Ap-ICL, z angl. Abasic site interstrand crosslink). Ap-ICL se tvoří spontánně z abazického místa kovalentní vazbou s adeninem na opačném řetězci. Nedostatek informací o opravných mechanismech, vlivu lokální sekvence a jeho stabilitě vede k otázkám ohledně osudu, toxicitě a výskytu těchto lézí v buňkách. Evoluce vytvořila několik mechanismů jak tato a další jiná poškození opravit a zajistit organismu jeho přetrvání. Nedávno objevená dráha známa pro opravu Ap-ICL dostala název po glykosylase zodpovědné za odstranění Ap-ICL. DNA glykosylasa NEIL3 je k Ap-ICL přivolána ubiquitylací DNA helikasy, která je součástí komplexu zodpovědného za replikaci DNA. Glykosylasa NEIL3 obsahuje několik domén s motivem zinkového prstu, které se vážou k poškozené DNA a zajišťují její katalytickou funkci. Momentálně není znám molekulární mechanismus opravného procesu glykosylasy NEIL3. S cílem odpovědět na zmíněné neznámé byla v předložené práci...
|
|
|
Structural studies of an abasic site DNA damage repair and DNA interstrand cross-link formation
Landová, Barbora ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Poškozením DNA se rozumí jakákoli změna nebo modifikace struktury DNA, která se odchyluje od jejího přirozeného stavu. Abasické místo (Ap místo) je jedním z nejčastějších poškození DNA, které vzniká spontánní depurinací/depyrimidinací nebo enzymatickým odstraněním báze. Pokud se neopraví, může vést ke genetické mutaci a potenciálně způsobit onemocnění, jako je například rakovina. Pochopení mechanismu opravy DNA je zásadní pro lékařský výzkum a aplikaci. Bakteriální MutM je glykosyláza opravující DNA, která odstraňuje poškození DNA vzniklé oxidačním stresem a zabraňuje mutacím a genomové nestabilitě. MutM patří do rodiny prokaryotických enzymů Fpg/Nei a je strukturně i funkčně podobná se svým eukaryotickým protějškům, jako jsou NEIL1-NEIL3. Zde prezentuji dvě krystalové struktury MutM z patogenní Neisseria meningitidis: MutM holoenzym a MutM vázaný na DNA. Volný enzym existuje v otevřené konformaci, zatímco po vazbě na DNA, dochází k podstatným strukturním změnám a přeskupení domén enzymu i ohybu DNA. Jednou z poškození DNA opravovaných MutM je Ap místo, které, pokud není opraveno, může spontánně vést k vytvoření mezivláknového kovanetního prokřízení DNA (Ap-ICL) se sousedním adeninem na opačném vlákně DNA. Je známo, že glykosyláza NEIL3 odstraňuje Ap-ICL. Pomocí série různých oligonukleotidů jsme...
|
|
|
Cancer Immunotherapy exploiting engineered antibody fragments against prostate-specific membrane antigen
Das, Gargi ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent) ; Ormsby, Tereza (oponent)
(Czech) Rakovina prostaty (PCa) představuje jednu z hlavních příčin mortality související s rakovinou v populaci mužů. Tento stav vyžaduje vývoj nových terapeutických přístupů přesahujících současnou konvenční léčbu s omezenou účinností. Prostatický specifický membránový antigen (PSMA) je jedním z nejpokročilejších biomarkerů pro zobrazování i terapii PCa díky své expresi specificky výrazně zvýšené neoplastických tkáních PCa a v metastatickém kastračně rezistentním karcinomu prostaty. Imunoterapeutické postupy zaměřené na PSMA skýtají v současné době velký potenciál jakožto nová platforma pro účinnou léčbu onemocnění. Předkládaná doktorská práce je zaměřena na inženýrství protilátkových fragmentů a fúzních proteinů odvozených z vysoce afinní monoklonální protilátky 5D3 specificky rozpoznávající PSMA. Cílem vývoje těchto molekul bylo dosažení specifického spojení imunitních buněk s biomarkerem PSMA vyvolávajícího eliminaci buněk prezentujících tento antigen. Za tímto účelem jsme zkonstruovali jednořetězcové variabilní fragmenty (scFv) protilátky 5D3, které byly následně fúzovány se sekvencemi anti-CD3 scFv a CP33, čímž jsme vytvořili fúzní proteiny specificky spojující imunitní buňky s T lymfocyty (BiTE) nebo s monocyty (5D3-CP33). Fúzní molekuly byly produkovány pomocí hmyzího expresního systému,...
|
|
|
Capturing chromatin-associated proteins in nucleosomal context
Koutná, Eliška ; Veverka, Václav (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
| 11 ABSTRAKT Eukaryotická DNA je v buněčném jádře ovinutá okolo histonových oktamerů, a tímto způsobem uložena ve formě nukleosomů. Tyto základní jednotky chromatinu poskytují vazebné rozhraní skrze DNA a N-koncové části histonů, které podléhají kovalentním posttranslačním modifikacím, jež v kombinaci s modifikacemi DNA definují epigenetický kód. Eukaryotická transkripce závisí na těchto specifických histonových modifikacích - jejich rozpoznávání chromatinovými reader proteiny spouští složité procesy, které spoléhají na koordinovanou asociaci transkripčních regulačních faktorů. Ačkoli různé typy modifikací konkrétního histonového residua často vedou k rozdílným funkčním důsledkům, není zcela jasné, jak jsou rozlišovány na molekulární úrovni. Kromě toho, význam vnitřně neuspořádaných oblastí mimo specializované reader domény pro vazbu na nukleosomy je dosud prozkoumán jen málo. Hlavní pozornost v této práci je věnována transkripčnímu koaktivátoru LEDGF/p75, který je schopen číst histonovou značku H3K36me2/3, a iniciačnímu transkripčnímu faktoru Sox2. Pomocí strukturně biologických a biofyzikálních technik je zkoumána interakce LEDGF a Sox2 s nukleosomy, přičemž jsou popsána specifika jejich vnitřně neuspořádaných motivů interagujících s DNA. Dvě cryo- EM struktury LEDGF vázaného na nukleosom...
|
|
|
Structural studies of metal-dependent hydrolases: Histone Deacetylase 6 and Glutamate Carboxypeptidase II
Shukla, Shivam ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Stříšovský, Kvido (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Hydrolasy závislé na zinku patří do třídy metaloenzymů, které obsahují zinečnaté kationty katalyzující hydrolytické reakce. Strukturní studie těchto enzymů jsou prováděny za účelem získání detailních informací o povaze jejich trojrozměrné struktury, organizaci domén a štěpení jejich přirozených substrátů. Tato práce popisuje strukturní charakteristiku dvou různých metalohydrolas 1) lidské histondeacetylasy 6 (HDAC6) a 2) glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) s využitím odlišné sady biofyzikálních technik. HDAC6 je strukturně unikátní vícedoménový enzym složený z nestrukturovaných a globulárních domén. Reguluje množství buněčných procesů odštěpováním acetylové skupiny z postranních řetězců lysinů vyskytujících se v cílových proteinech. Je známo, že HDAC6 deacetyluje substráty odlišné od histonů jako je tubulin, Hsp90, cortactin a peroxiredoxiny. Vzhledem k jeho strukturní komplexnosti jsou dostupné strukturní informace o HDAC6 omezeny pouze na jeho globulární domény. V této studii byl použit komplexní metodický přístup založený na integraci experimentálních dat získaných několika ortogonálními biofyzikálními technikami, který umožnil tvorbu strukturního modelu HDAC6 v roztoku. Získaný model ukazuje, že díky svým nestrukturovaným oblastem HDAC6 může zaujímat více konformací a v roztoku se pravděpodobně...
|
|
|
Neuronální buněčné kultury in vitro
Kohoutová, Šárka ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Neuronální buněčné kultury jsou in vitro kultury disociovaných neuronů, které se již v minulém století staly neodmyslitelnou součástí mnoha neurobiologických experimentů. Kultivované neurony umožňují nejen odpovědět na otázky ohledně jejich fyziologie v komplexních in vivo podmínkách, ale rovněž mohou sloužit jako modely neurodegenerativních onemocnění. Neuronální buňky lze izolovat buďto přímo z nervové tkáně živočichů v prenatálním či dospělém stádiu vývoje, nebo jsou získávány skrze cílené manipulace kmenových buněk a sekundárních buněčných linií, které vedou k jejich neuronální diferenciaci. Primární neurony jsou považovány za zlatý standard neurobiologického výzkumu nejen z důvodu, že jejich kultivace má dlouholetou tradici, ale také proto, že odráží typické vlastnosti neuronů v in vivo podmínkách. S primárními neurony je spojena řada nevýhod, včetně skutečnosti, že plně diferencované neurony neproliferují a jsou poměrně náročné na kultivační podmínky. Z tohoto důvodu jejich roli často nahrazují mitoticky aktivní sekundární buněčné linie či kmenové buňky. Tato bakalářská práce shrnuje poznatky o buněčných kulturách využívaných ke studiu funkcí nervových buněk a poukazuje na výhody a nevýhody jejich využití. Klíčová slova Primární neurony, primární hipokampální neurony, neurální kmenové buňky,...
|
|
|
Heat-shock protein 90 (HSP90) in cell physiology.
Karmazin, Alina ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Heat-shock protein 90 (HSP90) je molekulární chaperon, který představuje jeden z nejdůležitějších proteinů pro buněčnou homeostázu ve všech doménách života. Chaperony plní funkci molekul, které pomáhají ostatním proteinům ve správném sbalování a uspořádání jejich trojrozměrné struktury. HSP90 byl poprvé objeven jako protein tepelného šoku, později byla prokázána jeho důležitá role uzlu propojujícího mnoho buněčných funkcí zahrnující transcripci, translaci, opravu DNA, imunitní odpověd', buněčnou signalizaci atd. Není tedy překvapením, že HSP90 hraje roli také v patogenezi lidských onemocnění, např. u různých druhů rakoviny a u neurodegenerativních a respiračních chorob. Z tohoto důvodu se HSP90 stal cílem lékařského výzkumu. HSP90 je homodimer skládající se ze dvou protomerů, z nichž každý se skládá ze tří domén: N-terminální domény, střední domény a C-terminální domény. Pro splnění svých funkcí prochází HSP90 ATP- dependentním konformačním cyklem, kde je striktně regulován velkou skupinou pomocných proteinů - ko-chaperonů, stejně jako několika posttranslačními modifikacemi typu fosforylace a acetylace. O acetylaci je známo, že ovlivňuje vazbu HSP90 na nukleotidy, klienty a ko-chaperony, a proto je považována za kontrolní mechanismus funkce HSP90. Potenciálně lze acetylaci HSP90 využít při léčbě hormonálně...
|
|
|
Molekulární podstata interakcí mezi Dishevelled 3 (DVL3) a proteinovým regulátorem cytokineze 1 (PRC1)
Kropáčková, Veronika ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
Scaffolding protein Dishevelled (Dvl) je klíčovou součástí Wnt signalizačních kaskád. Podílí se na řadě biologických procesů, kterými jsou například proliferace, diferenciace a migrace buněk, určování buněčné polarity a také obnova kmenových buněk. Je nepostradatelný pro správný vývoj embrya i tkáňovou homeostázu v dospělosti. Proteinový regulátor cytokineze (PRC1) patří mezi proteiny asociované s mikrotubuly. Podílí se na tvorbě centrálního svazku antiparalelních mikrotubulů (tzv. spindle midzone) v průběhu buněčného dělení, který předchází vzniku kontraktilního prstence a je nezbytný pro správný průběh cytokineze. V naší laboratoři byl PRC1 identifikován jako potenciální interakční partner DVL3. Tato diplomová práce je zaměřena na vymezení interakčního rozhraní mezi DVL3 a PRC1 s využitím TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopie. K tomuto účelu byly navrženy, exprimovány a purifikovány přirozeně se vyskytující formy DVL a PRC1 a jejich zkrácené varianty. Bylo zjištěno, že PRC1 interaguje se všemi izoformami DVL a pro interakci mezi PRC1 a DVL3 je nezbytná N-terminální část PRC1 a že na interakci se zřejmě podílí DEP doména DVL3. Klíčová slova: Dishevelled 3, DVL3, Proteinový regulátor cytokineze 1, PRC1, interakční rozhraní, TIRF mikroskopie
|
host ::
RSS.