|
| |
|
| |
|
|
Hyaluronan in chondrogenesis of mesenchymal stem cells
Dvořáková, Jana ; Kobylka, Petr (vedoucí práce) ; Handl, Milan (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
5 SOUHRN PRÁCE Hlavním cíleM práce bylo vyvinout metodiku přípravy chondrogenního štepu pro možné využití v léčbě poškozené kloubní chrupavky. Tento štěp by měl být založen na kombinaci oporného materiálu (skefoldu) na bázi hyaluronanu s mezenchymálními kmenovými buňkami (MSC). V prvním fázi projektu byl vytvořen přehled známých derivátů hyaluronanu s potenciálním využitím v medicíně. (Sedova, Knotkova et al. 2007) Na základě tohoto přehledu byl pro další využití vybrán hydrogel připravovaný síťováním tyraminového derivátu hyaluronanu působením peroxidázy (HA-TA skefold). Pro experimenty s MSC bylo třeba optimalizovat dostatečně bohatý, spolehlivý a eticky přijatelný zdroj buněčného materiálu. Tento zdroj byl nalezen a ověřen v podobě výplachů odběrových setů používaných pro odběry kostní dřeně při transplantacích. (Dvorakova, Hruba et al. 2008) V rámci projektu bylo nutné stanovovat viabilitu MSC. Na základě porovnání tří různých metod, byla vybrána jako nejvhodnější luminiscenční metoda založená na stanovení intracelulárního ATP, která respektuje specifity MSC - především morfologické změny v průběhu kultivace a nízké nasazovací hustoty. (Vistejnova, Dvorakova et al. 2009) V dalším kroku byl sledován vliv nativního rozpustného hyaluronanu na průběh chondrogenní diferenciace MSC v modelovém peletovém...
|
|
|
Chemická enukleace u savčích oocytů
Černá, Martina ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Předchozi techniky enukleace byly nepřesne a časově naročne. Často se využiva barveni jaderne DNA pomoci Hoechstu, přičemž je barvivo pro oocyt jedovate a ma vliv na jeho dalši vyvoj.Chemicka enukleace je metoda, ktera usnadni vznik cytoplastů ve většim množstvi a v kratšim čase. Budoucnost chemicke enukleace se nachazi na poli biotechnologickem, a to zejmena v oblasti jaderneho přenosu (terapeuticke, reprodukčni klonovani). Chemicka enukleace byla uspěšně provedena u několika modelovych zviřat:myš, ovce, skot. Avšak u prasat je tato technika stale vylepšovana, vzhledem k podobnosti s člověkem, kde by se měla později uplatnit. Bylo zjištěno, že u každeho druhu působi stejne chemikalie jinym způsobem na oocyt a tudiž je nutne zkoumat každy druh zvlašť.Proto byly hledany chemicke latky působici na praseči oocyty, tak aby došlo k vytvořeni vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion). Jako nejvhodnějši pro chemickou enukleaci jsme stanovili demekolcin v koncentraci 0,4 Ug/ml a doba působeni 30 minut (ktery zastavuje polymeraci tubulinu). Dale cytochalasin B v koncentraci 7,5 Ug/ml a doba působeni 10 minut. Uspěšny vznik vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion) koreluje s kvalitou oocytů. Dale jsme se zaměřili na distribuci mitochondrii po fuzi enukleovaneho a neenukleovaneho oocytu. Rovnoměrnou...
|
|
|
Transfekce kmenových a jiných testikulárních buněk Xenopus tropicalis
Šídová, Monika ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Xenopus tropicalis je jedním z nejvýznamnějších modelových organismů, který je využíván, jak ve vývojové biologii, tak i v buněčné biologii. V laboratoři vývojové biologie, Přf UK se podařilo úspěšně založit dlouhodobou primární kulturu juvenilních buněk varlat X. tropicalis. Na základě genové exprese příslušných markerů (Sox9, WT1 atd.) bylo dokázáno, že převládajícím buněčným typem kultury jsou pre-Sertoliho buňky, které umožňují dlouhodobou kultivaci kolonií zárodečných kmenových buněk. Kmenovost těchto buněk byla prokázána přítomností alkalické fosfatázy v koloniích. Cílem této diplomové práce byla optimalizace práce se smíšenou buněčnou kulturou a to zejména stanovení podmínek disociace kolonií zárodečných kmenových buněk, jejich separace od podpůrné vyživovací vrstvy pre-Sertoliho buněk a na závěr určení vhodných podmínek transfekce buněk X. tropicalis. Zvládnutí všech uvedených technik nabízí možnost zkoumat nejen úplnou funkci zárodečných kmenových buněk a jejich diferenciaci, ale i možný nástroj pro inaktivaci různých genů a další experimenty spojené s transgenezí. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Transgenic RNAi in mouse oocytes
Sarnová, Lenka ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Svoboda, Petr (vedoucí práce)
RNA interference (RNAi) is double-stranded RNA (dsRNA)-mediated mRNA degradation. RNAi has been widely used to investigate gene functions. Many methods to induce transient or stable RNAi have been developed. Transient RNAi can be induced by delivering of a long dsRNA or short interfering RNAs (siRNAs). Stable RNAi may be induced by introducing plasmids expressing a long or a short hairpin RNA. Both small and long RNAs have been used to induce transient RNAi in mouse oocytes. Nevertheless, only long hairpin-expressing system has been used to trigger stable RNAi in oocytes. Although, this system appeared to be highly efficient and specific, it has several disadvantages as complicated long inverted repeat cloning or limited possibility to test these vectors in the cell culture. Here, we constructed a short hairpin-expressing vector suitable for transgenic RNAi induction in mouse oocytes. The new vector, pTMP_ZP3_sh, was derived from a lentiviral short hairpin vector selected based on comparative study of different short hairpin-expressing plasmids. The pTMP_ZP3_sh vector was tested by targeting Moloney sarcoma oncogene (Mos) mRNA, which is a common model for RNAi in mouse oocytes. We designed several candidate short hairpin sequences and tested their efficacy. Subsequently, the most efficient one was selected...
|
|
| |
|
|
Genová exprese v průběhu expanze oocyt-kumulárních komplexů a časného embryonálního vývoje savců
Němcová, Lucie ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Lopatářová, Miloslava (oponent)
31 4 SHRNUTÍ Zavedla jsem real-time RT-PCT mezi základní metodiky, využívané v naší laboratoři. Během in vitro kultivace prasečích oocytů, kumulárních a granulózních buněk a in vivo expanze oocyt kumulárních komplexů byl stanoven expresní profil GDF9 mRNA, proteinu z rodiny TGFβ faktorů. Získaná parciální sekvence byla vložena do databáze EMBL/GenBank/DDBJ a gen byl lokalizován na prasečím chromozomu 2. Na rozdíl od myši byl transkript detekován poprvé též v granulózních i kumulárních buňkách rostoucích a preovulačních folikulů. Hladina GDF9 mRNA během in vitro kultivace i in vivo expanze klesala ve všech vzorcích. Popsali jsme signální dráhy, kterými insulínový růstový faktor I (IGFI) zvyšuje FSH-stimulovanou expanzi oocyt-kumulárních komplexů. Potvrdili jsme, že IGFI v kombinaci s FSH zvyšuje produkci hyaluronové kyseliny. Během kutivace kumulárních buněk s FSH došlo k postupnému snížení exprese Has2 mRNA. Avšak po 20 hodinách byla hladina stále detekovatelná v případě, kdy byl do média přidán i IGFI. Pomocí inhibitorů Akt a MAP kinázy jsme prokázali, že aktivita obou kináz je důležitá pro produkci i retenci HA. U bovinních blastocyst, připravených za rozdílných experimentálních podmínek (in vitro, in vivo v ovčím vejcovodu a v kombinaci obou způsobů) byla stanovena exprese genů pro Bax, L37 a S3a. V...
|
|
|
Vliv ubiquitinace spermií v rámci časného embryonálního vývoje u prasete
Petelák, Aleš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Metoda intracelulární injekce spermie je velmi efektivním nástrojem pro výzkum oplození. Po vytvoření nové laboratoře na půdě PřF UK bylo nutné nejdříve tuto metodu zavést a charakterizovat časný embryonální vývoj oplozených oocytů. Oocyty byly po oplození kultivovány do stadia blastocysty s úspěšností srovnatelnou s jinými laboratořemi (17%). Ubiquitin-proteazomální systém, který v buňce zajišťuje degradaci proteinů, se účastní regulace maturace a selekce spermií a je nezbytný pro penetraci vitelinní membrány. V těchto dějích je jeho funkce lokalizována extracelulárně. U spermií míra ubiquitinace koreluje s jejich kvalitou. Hypoteticky lze tedy předpokládat, že ubiquitinace nekvalitních spermií slouží jako negativní marker pro jejich rozpoznání a degradaci oocytárním 26S proteazomálním komplexem. Experimenty byly plánovány na základě předpokladu, že výkonnou částí selekčního mechanismu je 26S proteazom a z tohoto důvodu byl sledován vliv inhibice 20S proteazomu, pomocí peptidu MG132, na formování prvojader a následný časný embryonální vývoj po ICSI. Z pohledu zahájení dekondenzace spermie se neprojevil žádný účinek inhibice. Signifikantní rozdíl byl pozorován ve formování prvojader. U skupiny s MG132 docházelo k tvorbě prvojader jen v malém počtu případů (17%, 9%), oproti skupině bez inhibitoru...
|
|
|
Analysis of short Argonaute isoforms from mouse oocytes
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Analýza kratkých isoforem proteinů Argonaůt z mýsích oocýtů Abstrakt: Proteiny z rodiný Argonaůtů, řízené malými molekůlami RNA, představůjí konzervované jádro mechanismů ůmlčování RNA (RNA silencing). Týto mechanismý potlačůjí prodůkci virů, šíření mobilní DNA, a regůlůjí genovoů expresi na základě sekvenční informace nesené asociovanou RNA. V somatických bůňkách savců je dominantním mechanismem regůlační microRNA (miRNA) dráha. Malé miRNA ovlivňůjí expresi většiný savčích genů. Argonaute proteiny inhibůjí translaci a indůkůjí deadenylaci mRNA s částečnoů homologií k navázané miRNA. Deadenylace obvykle výústí degradaci mRNA. Těmito mechanismý miRNA dráha citlivě kontrolůje hladiný prodůkovaných proteinů. Na rozdíl od příbůzného mechanismů RNA interference (RNAi) výůžívajícího katalyticky aktivní proteiny Argonaute schopné rozštěpit komplementárních molekuly RNA, miRNA ůmlčování je závislé na celé řadě dalších faktorů. Role miRNA regulace v komplexních biologických procesech od organogeneze, přes krvetvorbů až po rakovinu je dobře doložená. Mýší oocýtý postrádající kanonické miRNA jsoů překvapivě schopné oplození a úspěšně projdoů preimplantačním vývojem. Ani nejčetnější oocýtární miRNA však nejsou sto efektivně ůmlčet cílové gený, přestože příbůzný mechanismůs RNAi, sdílející s miRNA mechanismem klíčové...
|
host ::
RSS.