|
| |
|
|
Proteomic Analysis of Trichomonas vaginalis hydrogenosone
Campo Beltran, Neritza ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Nohýnková, Eva (oponent) ; Yarlett, Nigel (oponent)
Trichomonas vaginalis je lidský parazit, který ročně ohrožuje přibližně 258 milionů lidí. U tohoto parazita byla popsána organela mitochondriálního původu nazvaná hydrogenosom, která je schopná vytvářet energii v podobě ATP za anaerobních podmínek. Zkoumání a popisování nových proteinů, vyskytujících se v této organele, může přispět k objevení nových cílů pro antiparazitární léčbu. Zároveň nám tento výzkum pomůže porozumět fungování a evolučnímu původu této odvozené organely. Dostupnost již popsaných protokolů pro izolaci hydrogenosomů společně s kompletně zmapovaným genomem T. vaginalis umožňuje studovat tyto organely pomocí moderních metod hmotnostní spektrometrie a bioinformatických analýz. V rámci našeho výzkumu jsme použili různé přístupy umožňující popsat proteiny v těchto organelách. Jednalo se o transkriptomické a proteomické analýzy zjišťující buněčnou odpověď parazita T. vaginalis na změny koncentrace železa v prostředí. A dále změny v obsahu proteinů hydrogenosomů u T. vaginalis rezistentních na metronidazol. Organely byly v obou případech izolovány pomocí diferenciální centrifugace gradientu OptiPrepu. Takto připravené hydrogenosomy byly analyzovány hmotnostním spektrometrem pomocí nano-RP- HPLC/MALDI-TOF/TOF. Zároveň jsme pomocí Tritonu X-114 oddělili membránové a matrixové proteiny a...
|
|
|
Biogenesis of mitochondria in parasitic protist Trypanosoma brucei
Mach, Jan ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Yurchenko, Vyacheslav (oponent) ; Hashimi, Hassan (oponent)
Výzkum zaměřený na mitochondrie, včetně jejich redukovaných forem, jako jsou hydrogenosomy a mitosomy, vedl v poslední době u této nepostradatelné organely k objevu nečekané diverzity. Je zajímavé, že mitochondrie parazitického prvoka Trypanosoma brucei je schopna, v závislosti na dostupných zdrojích uhlíku, projít pozoruhodnými funkčními a strukturními změnami. Mimoto bylo navrženo, že trypanosomy patří mezi nejstarší známá eukaryota a jako taková vzbuzuje jejich mitochondrie u biologů o to větší zájem. Abychom přispěli k poznání mitochondriální biogeneze a funkce, zaměřili jsme se na studium dvou klíčových mitochondriálních procesů, štěpení preproteinů importovaných do mitochondrie a mechanismus transportu pyruvátu do těchto organel. Navíc jsme studovali příjem železa do T. brucei. Tento kov je nezbytný pro funkci mnoha proteinů, především pro železo-sirné mitochondriální proteiny. Evoluční historie trypanosom a jejich mitochondrie je sporná. Na základě některých zpráv představuje mitochondrie trypanosom původní formu této organely, což je podpořeno objevením domnělé archaické translokázy vnější mitochondriální membrány (ATOM) a jediného typu translokázy, tvořící pór na vnitřní mitochondriální membráně. My jsme naopak identifikovali a charakterizovali mitochondriální procesující peptidázu v...
|
|
|
Iron containing cofactors in anaerobic parasite Giardia intestinalis
Pyrih, Jan ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Martásek, Pavel (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Železo je nepostradatelným prvkem téměř pro všechny organismy. Nejčastěji je v buňce přítomné jako součást železitosirných (FeS) klastrů a hemu. Díky těmto kofaktorům mají proteiny schopnost katalyzovat enzymatickou reakci, přenášet elektrony a plyny a nebo detekovat signál. Mnoho FeS a hemových proteinů se účastní dobře prostudovaných drah, jako je fotosyntéza nebo dýchací řetězec. Nicméně o syntéze FeS klastrů v různých buněčných kompartmentech nebo o roli nově objevených FeS nebo hemo-proteinů se stále mnoho informací neví. Velmi málo je známo především o tom, jak jsou u anaerobně žijících protistů FeS klastry formovány nebo jak je využíván hem. V těchto organismech se totiž dráhy dýchacího řetězce či fotosyntézy nevyskytují. Rozhodli jsme se proto zaměřit na železo obsahující kofaktory u anaerobního parazita Giardia intestinalis. Tento organismus prošel dramatickou reduktivní evolucí, jejímž výsledkem je vznik jednoho z nejmenších eukaryotických genomů a nejvíce redukované formy mitochondrie - mitosomu. Charakterizovali jsme některé komponenty mitochondriální (ISC) a cytoplasmatické (CIA) FeS klastrovací dráhy. Pomocí proteomické analýzy jsme nejprve detekovali komponenty dráhy ISC v mitosomu. Poté jsme analyzovali přítomnost a buněčnou lokalizaci CIA proteinů. V genomu G. intestinalis jsme...
|
|
|
FeS cluster assembly in cytosol of Trichomonas vaginalis
Stojanovová, Darja ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Železo-sirné klastry jsou kofaktory celé řady významných proteinů. Pro studium syntézy těchto klastrů se využívají především modelové organismy typu Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens a v poslední době také Trypanosoma brucei. U Trichomonas vaginalis, anaerobního prvoka, který parazituje v urogenitálním traktu lidí, však nebylo toto téma studováno více do hloubky. T. vaginalis patří mezi anaeroby, jejichž mitochondrie byla redukována na hydrogenosom. V této organele již byly identifikované některé komponenty ISC dráhy pro syntézu klastrů, zatímco proteiny, které se účastní CIA dráhy v cytosolu, nebyly u T. vaginalis doposud charakterizovány. Tato práce se zabývá především TvIscU, jedním z hlavních proteinů ISC dráhy, a dále také komponenty CIA dráhy. Oba dva typy syntézy klastrů, jak v hydrogenosomech tak i v cytosolu, se zásadně liší od typického modelu založeném na studiu S. cerevisce. V této práci jsme studovali hypotetické funkční propojení ISC-CIA systému. Dále jsme identifikovali homology k charakterizovaným proteinům účastnících se CIA dráhy. Konkrétně jsme identifikovali Nbp35, Cfd1, Nar1, Cia1 Cia2, avšak nenalezli jsme proteiny homologní pro Tah18, Dre2 a Mms19. Nalezené proteiny jsme v T. vaginalis exprimovali značené Ha-tagem a lokalizovali je v buněčných frakcích a pomocí...
|
|
|
Metody reverzní genetiky u anaerobních prvoků
Stojanovová, Darja ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Tato práce je primárně zaměřená na metody reverzní genetiky u anaerobních prvoků. Jelikož se jedná o široké téma, metody popisované v této práci jsou vybrané s přihlédnutím konkrétně k parazitům člověka T. vaginalis, G. intestinalis a E. histolytica. Jako metody reverzní genetiky se označují postupy umožňující manipulaci s geny na úrovni DNA a RNA za účelem porozumět jejich vlastnostem a funkci. Získané znalosti umožňují v laboratořích zabývajících se parazitickými prvoky odhalovat příčiny jejich patogenity a usnadňovat tak například hledání nových léčiv. V neposlední řadě umožňují tyto znalosti porozumět metabolismu a buněčným funkcím, které jsou u prvoků často velmi specifické nebo naopak redukované. Mezi metody reverzní genetiky na úrovni DNA, které působí trvalou změnu cílové sekvence, patří homologní rekombinace nebo integrace cizorodé DNA do genomu. Dočasné nebo trvalé změny v expresi genů mohou být realizovány pomocí transkripčního umlčování genů, kde sekvence DNA zůstává beze změny, avšak dochází k represi exprese. Transkripční umlčování genů může být navozeno řadou mechanismů, například je v některých případech funkčně propojené s dráhou RNA interference, která se běžně uplatňuje u posttranskripčního umlčování genů na úrovni mRNA. Další techniky umlčování exprese genů rozebírané v této...
|
|
|
Výskyt patogenních trichomonád u koček a psů
Vobořilová, Pavlína ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Hampl, Vladimír (oponent)
Trichomonády jsou anaerobní bičíkovci zahrnující komenzální a parazitické druhy, kteří se často vyskytují v zažívacím, respiračním a urogenitálním traktu obratlovců včetně psů a koček. U těchto hostitelů byli v ústní dutině popsáni dva komenzálové Tetratrichomonas canistomae a Tetratrichomonas felistomae. V zažívacím traktu psů a koček byl pak popsán komenzál Pentatrichomonas hominis, který se také vyskytuje u jiných savců včetně lidí, a patogen Tritrichomonas foetus způsobující chronické průjmové onemocnění u koček. Ačkoli jsou trichomonády u psů a koček pravděpodobně kosmopolitně rozšířeny, jejich výskyt v České republice není znám. Cílem této studie bylo (i) rozlišit druhy trichomonád přítomných v orální dutině psů a koček a získat předběžná epidemiologická data a (ii) prokázat přítomnost Tritrichomonas foetus u psů a koček v České republice a stanovit potenciální rizikové faktory s nákazou. Přítomnost trichomonád u psů a koček byla diagnostikována kultivací a pomocí "nested" PCR. Určení trichomonád do druhu bylo provedeno na základě sekvenční a fylogenetické analýzy úseku genu ITS1-5.8SrRNA-ITS2. Dodatečně druhová příslušnost byla ověřena morfologicky. Trichomonády byly diagnostikovány u různých populací psů a koček a informace o každém zvířeti včetně zdravotního stavu byla zaznamenána do...
|
|
|
Mitochondrie anaerobních prvoků
Stoklasa, Michal ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Rada, Petr (oponent)
Mitochondrie jsou organely endosymbiotického původu, tvořící energetické centrum eukaryotické buňky. Vzniká zde adenosintrifosfát (ATP), který je využíván jako zdroj energie pro většinu metabolických reakcí, probíhajících v buňce. Kromě toho se mitochondrie podílí na programované buněčné smrti (apoptóze) a probíhá zde β-oxidace mastných kyselin a syntéza Fe-S center, hemu a steroidů. Při adaptaci na prostředí s nedostatkem kyslíku došlo u některých parazitických (Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica) nebo volně žijících prvoků (Sawyeria marylandensis, Mastigamoeba balamuthi) k redukci většiny mitochondriálních funkcí. Cílem této bakalářské práce je shrnout poznatky o těchto redukovaných mitochondriálních organelách anaerobních prvoků a popsat jejich konkrétní metabolismus. Klíčová slova: mitochondrie, hydrogenosom, mitosom
|
|
|
Evolution of hydrogenosomes: adaptation of free living protists Mastagamoeba balamuthi and Naegleria gruberi to oxygen-poor environment
Nývltová, Eva ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; TIELENS, Aloysius Gerard Marie (oponent) ; Markoš, Anton (oponent)
Celá řada prvoků patřící do různých eukaryotických skupin je schopná žít v prostředí chudém na kyslík. Adaptace jejich metabolismu k tomuto prostředí je obvykle spojená se ztrátou typických mitochondriálních funkcí jako je citrátový cyklus nebo dýchací řetězec. Anaerobní formy mitochondrie tak produkují ATP výhradně pomocí substrátové fosforylace (vyskytující se v anaerobních mitochondriích produkujících vodík nebo hydrogenosomech) nebo schopnost produkce ATP úplně ztratily, jako je tomu u mitosomů. V důsledku těchto změn je redukovaný i proteom těchto anaerobních mitochondrií. Stále zůstává otázkou zda se tyto anaerobní formy mitochondrie vyvinuly přímo z endosymbiotického pra-předka mitochondrie nebo jsou důsledkem sekundární redukce jako odezva na prostředí chudé na kyslík. Améba z eukaryotní skupiny Amoebozoa, Mastigamoeba balamuthi, je potencionálně zajímavý pro studium redukce mitochondrie. Tato améba je totiž blízce příbuzná dvěma velmi odlišným organismům: (i) aerobní a volně žijící hlence Dictyostelium, u které najdeme klasickou aerobní, plně funkční mitochondrii, a zároveň (ii) anaerobnímu parasitovi Entamoeba histolytica, u které nalézáme nejvíc redukovou formu mitochondrie nazvanou mitosom. Mitochondriální organely, nalezené u anaerobní avšak volně žijící M. balamuthi, by mohly...
|
|
|
Chromosomes of parasitic protist Trichomonas vaginalis
Zubáčová, Zuzana ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Alsmark, Cecília (oponent) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Program: Biomedicína/Parazitologie Abstrakt disertační práce Chromosomy parazita Trichomonas vaginalis Mgr. Zuzana Zubáčová Školitel: Prof. RNDr. Jan Tachezy, Ph.D. Abstrakt Sekvenování genomů a přidružené proteomické studie způsobily převrat ve výzkumu v oblasti molekulární parazitologie. Postupující sekvenování jak parazitických, tak i volně žijících druhů umožňuje srovnávací a fylogenetické studie, a je rovněž zdrojem důležitých dat pro pochopení jejich základní biologie a identifikaci nových cílů terapie parazitárních nákaz. Sekvenování DNA parazita Trichomonas vaginalis překvapivě odhalilo u tohoto lidského patogena genom o velikosti až ~160 Mb. Zjistilo se, že expanze genomu je výsledkem zmnožení repetitivních sekvencí, specifických genových rodin a duplikací rozsáhlých částí genomu. Analýzou obsahu jaderné DNA u 9 příbuzných druhů trichomonád pomocí průtokové cytometrie jsem zjistila, že expanze velikosti genomu není specifická jen pro T. vaginalis, ale i ostatní druhy se vyznačují velkými genomy (86-177 Mb). Největší genomy mají zástupci rodů Trichomonas a Tritrichomonas, nejmenší genom jsme zjistili u druhu Tetratrichomonas gallinarum. Velikosti genomů trichomonád pozitivně korelovaly s objemy jejich buněk. Nepozorovali jsme korelaci mezi velikosti...
|
host ::
RSS.