|
|
Jsou současně používané chelátory těžkých kovů také chelátory vápníku a horčíku?
Skoupilová, Karolína ; Mladěnka, Přemysl (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Karolína Skoupilová Školitel: prof. PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Název diplomové práce: Jsou současně používané chelátory těžkých kovů také chelátory vápníku a hořčíku? Vápník a hořčík jsou důležitými prvky pro lidské tělo. Vápník hraje důležitou roli při srážení krve a vnitrobuněčné signalizaci, podílí se tak mimo jiné na svalové kontrakci ale i na agregaci krevních destiček. Hořčík je kofaktorem mnoha enzymů. Výrazný nedostatek obou iontů se může projevovat poruchami srdečního rytmu a zvýšenou nervosvalovou dráždivostí. Cílem této práce bylo stanovení chelatační aktivity u současně používaných chelátorů těžkých kovů a stanovit stabilitu indikátoru. Nejdříve bylo zjištěno ideální pH pro experiment. V dalším kroku byla změřena míra chelatace u 21 známých chelátorů kovů pomocí spektrofotometrické metody in vitro. Nakonec byla chelatace u nejvíce aktivních chelátorů vápníku ověřena na agregaci krevních destiček ve vzorku lidské krve. Zároveň byla stanovena dlouhodobá stabilita indikátoru o-kresolftalein komplexonu (CC). V prvním kroku bylo zvoleno pH 7,5, které jako jediné bylo z důvodu dobré citlivosti použitelné pro naše měření. Nejvíce účinnými látkami chelatujícími vápník byly ADR-925,...
|
|
|
From iron metabolism in parasitic protists to drug discovery
Arbon, Dominik ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; De Koning, Harry P. (oponent) ; Petrák, Jiří (oponent)
(Česky) Železo je nezbytný prvek pro mnoho biochemických dějů. Většina živých organismů využívá komplexních strategií pro udržení homeostázy tohoto prvku, včetně specifických metod jeho příjmu a vnitrobuněčného toku, aby mohl být inkorporován do různých biologických drah a buněčných kompartmentů. Napříč doménou parazitických prvoků hraje železo významnou roli při interakcích mezi patogenem a jeho hostitelem, kdy kompeticí o železo vzniká takzvaná nutriční imunita. Tato práce shrnuje současný stav poznání o příjmu a homeostázi železa u vybraných fakultativních a obligátních jednobuněčných parazitů a předkládá výsledky výzkumu o příjmu železa a o vlivu jeho nedostatku u parazitických prvoků Naegleria fowleri a Acanthamoeba castellanii. Na základě těchto poznatků je na teoretické i praktické rovině posouzena možnost využití chelátorů železa pro terapeutické účely. Navazující práce se soustředí na využití mitochondriálního cílení látek, včetně chelátorů železa, jako prostředku pro zlepšení terapeutického účinku proti spektru parazitů a také popisu jejich účinku in vitro a in vivo.
|
|
|
Metabolismus mědi u Acanthamoeba castellanii
Doležalová, Taťána ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Mladěnka, Přemysl (oponent)
Měď je esenciální prvek, který je díky svým redoxním vlastnostem zapojen jako kofaktor do mnoha enzymů, nejznámějším příkladem je cytochrom c oxidáza. Zároveň se tento prvek ve větší koncentraci projevuje toxickým působením na několika úrovních, dokáže narušovat železo-sirné klastry, poškozovat proteiny a vést k buněčné smrti. To je důvod, proč se tato práce zabývá metabolismem mědi u parazitické améby Acanthamoeba castellanii, která způsobuje vážná onemocnění jako je akantamébová keratitida či granulomatózní amébová encefalitida. Pochopení principu, kterým je udržována homeostáza mědi v tomto organismu, by mohlo vést k cílenému narušení této rovnováhy a využití toxických účinků mědi. V této práci byla na základě funkční komplementace popsána funkce ATPázy P-typu jako homologická k CCC2 ze Saccharomyces cerevisiae, která je zodpovědná za přenos iontů mědi z cytoplazmy do Golgiho aparátu. Dále byl popsán přenašeč z rodiny Ctr, který přenáší ionty mědi pravděpodobně přes cytoplazmatickou membránu. Byla sledována exprese těchto přenašečů v nadbytku a nedostatku mědi. Pro lepší představu, jak A. castellanii udržuje homeostázu mědi bylo pomocí metody ICP-MS popsáno, jaké množství mědi se v buňce akumuluje a jak je tato améba schopná vylučovat nadbytečné ionty mědí. Posledním tématem práce je užití...
|
|
|
Vliv predace amébami na evoluci virulence lidských patogenních mikroorganismů
Drncová, Eliška ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Konupková, Anežka (oponent)
Améby působí jako jedni z hlavních regulátorů mikrobiálních společenstev, kde v důsledku jejich predace je vyvíjen selekční tlak pro vznik obranných mechanismů k dosažení rezistence. Tato adaptace umožňuje mikroorganismům náhodně infikovat lidský organismus a úspěšně se bránit složkám vrozené imunity, zejména makrofágům, které stejně jako améby jsou fagocytujícími buňkami. Projev virulence u oportunistických patogenů je způsoben konzervovanými drahami makrofágů sloužícím pro degradaci pohlceného materiálu, se kterými se mikroorganismus setkal již u améb. Díky této podobnosti lze využívat améby pro výzkum interakce mezi patogenem a jeho hostitelem, což zahrnuje i výzkum mechanismů virulence mnoha lidských mikrobiálních nákaz. Mezi nejpodrobněji zkoumané organismy, jejichž patogenita je výsledkem dlouhodobé interakce s amébami, patří bakterie Legionella pneumophila a mikroskopická houba Cryptococcus neoformans s velmi odlišnými strategiemi a projevy virulence. Porozumění evolučních souvislostí a výhod, které mikroorganismy získávají během interakce s amébami, nám podává informace o původů virulence oportunistických lidských patogenů.
|
|
|
Effect of various stress factors on mitochondrial processes of pathogenic protists
Ženíšková, Kateřina ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; van Hellemond, Jaap (oponent) ; Leitsch, David (oponent)
Mitochondrie plní v buňkách různé důležité funkce. Jsou hlavním místem energetického metabolismu, biosyntetických a regulačních procesů a také centrem metabolismu železa. Kromě toho jsou mitochondrie také ústřední organelou odpovědnou za produkci potenciálně nebezpečných reaktivních forem kyslíku a disponují sebedestruktivním arzenálem schopným vyvolat apoptózu celé buňky. Tato jediná organela tak řídí osud celé buňky. Vzhledem k těmto skutečnostem se tato organela stala středem zájmu mnoha vědců a farmaceutických společností vyvíjejících léčiva cílená na mitochondrie. Jednobuněční parazité si během evoluce vyvinuli několik mechanismů, jak přežít, bránit se a rozmnožovat se v nepřátelském prostředí svého hostitele. Jedním z těchto mechanismů je schopnost přizpůsobit svůj mitochondriální metabolismus k udržení životaschopnosti celé buňky. Tato práce se zaměřuje na mitochondrie ze dvou různých hledisek: Za prvé, s ohledem na fenomén nutriční imunity, jsme studovali vliv deprivace železa a mědi na mitochondrie "mozkožravé" améby Naegleria fowleri. Proteomická analýza buněk předem preinkubovaných se specifickými chelátory, spolu se stanovením aktivit enzymů a měřením spotřeby kyslíku ukázala, že mitochondrie N. fowleri se těmto limitujícím faktorům přizpůsobují upregulací alternativních složek...
|
|
|
Iron and copper transporters in amphizoic amoebae "Naegleria fowleri" and "Acanthamoeba castellanii"
Grechnikova, Mariia ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Lorenzo Morales, Jacob (oponent) ; Maciver, Sutherland (oponent)
Amfizoické améby Naegleria fowleri a Acanthamoeba castellanii jsou rozšířeny po celém světě a vyskytují se v různých přírodních i antropogenních prostředích. N. fowleri může u zdravých jedinců způsobit vzácné, ale smrtelné onemocnění mozku zvané primární amébová meningoencefalitida, jejíž úmrtnost přesahuje 95 %. Infekce vzniká, pokud se améby z kontaminované vody dostanou do nosu. A. castellanii může infikovat centrální nervový systém pacientů se sníženou imunitou a způsobit u nich granulomatózní amébovou encefalitidu s mírou přežití 2-3 %, dale může infikovat oči zdravých lidí, což vede k závažné infekci ohrožující zrak zvané akantamébová keratitida. N. fowleri a A. castellanii jsou aerobní organismy a vyžadují kofaktory železo a měď. Oba kovy jsou klíčové pro téměř všechny známé organismy a v nadbytku jsou toxické, takže patogeny přísně kontrolují homeostázu železa a mědi, což je rozhodující pro jejich virulenci. Dostupných informací o homeostáze kovů u amfizoických améb je však málo. Cílem této práce bylo charakterizovat některé mechanismy, které N. fowleri a A. castellanii využívají k získávání a detoxikaci železa a mědi. Navzdory podobné morfologii a způsobu života studovaných améb jsou jejich mechanismy homeostázy železa v podmínkách s limitujícím obsahem železa zcela odlišné. Obě améby...
|
|
|
Role železa ve virulenci Acanthamoeba castellanii
Šimáčková, Aneta ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Krijt, Matyáš (oponent)
Železo je nezbytná živina pro všechny živé organismy. Má zásadní úlohu ve virulenci patogenních bakterií i parazitických eukaryot. I když je železo hojným prvkem v organismu hostitele, není pro parazita snadné ho získat. Schopnost parazitů vyvolat onemocnění závisí z velké části na tom, jak účinné mechanismy pro zisk železa vyvinuli. Tato práce se zabývá vlivem železa na virulenci Acanthamoeba castellanii. Je to volně žijící améba, která za výjimečných situací může u člověka vyvolat smrtelné zánětlivé onemocnění mozku nebo člověku poškodit zrak. Kultivací se savčími buňkami se nám povedlo prokázat vliv železa na virulenci améby za využití průtokové cytometrie. Na základě fluorescenčního značení jsme lokalizovali protein AC_IDIP (Iron-Deprivation Induced Protein) v cytosolu. Tento protein byl také izolován a byla proti němu vytvořena polyklonální protilátka, která byla použita ke sledování vlivu dostupnosti železa na hladinu AC_IDIP. Pomocí komparativní proteomické analýzy jsme byli schopni sledovat změny v proteomu A. castellanii v závislosti na zdroji živin. Identifikovali jsme velké množství proteinů, jež měly změněnou hladinu za podmínky, kde zdrojem živin byly savčí buňky. Jednalo se zejména o cytoskeletální proteiny. Oproti tomu zastoupení proteinů obsahujících železo, nebo se na jeho...
|
|
|
FeS cluster assembly in cytosol of Trichomonas vaginalis
Stojanovová, Darja ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Železo-sirné klastry jsou kofaktory celé řady významných proteinů. Pro studium syntézy těchto klastrů se využívají především modelové organismy typu Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens a v poslední době také Trypanosoma brucei. U Trichomonas vaginalis, anaerobního prvoka, který parazituje v urogenitálním traktu lidí, však nebylo toto téma studováno více do hloubky. T. vaginalis patří mezi anaeroby, jejichž mitochondrie byla redukována na hydrogenosom. V této organele již byly identifikované některé komponenty ISC dráhy pro syntézu klastrů, zatímco proteiny, které se účastní CIA dráhy v cytosolu, nebyly u T. vaginalis doposud charakterizovány. Tato práce se zabývá především TvIscU, jedním z hlavních proteinů ISC dráhy, a dále také komponenty CIA dráhy. Oba dva typy syntézy klastrů, jak v hydrogenosomech tak i v cytosolu, se zásadně liší od typického modelu založeném na studiu S. cerevisce. V této práci jsme studovali hypotetické funkční propojení ISC-CIA systému. Dále jsme identifikovali homology k charakterizovaným proteinům účastnících se CIA dráhy. Konkrétně jsme identifikovali Nbp35, Cfd1, Nar1, Cia1 Cia2, avšak nenalezli jsme proteiny homologní pro Tah18, Dre2 a Mms19. Nalezené proteiny jsme v T. vaginalis exprimovali značené Ha-tagem a lokalizovali je v buněčných frakcích a pomocí...
|
|
|
Metabolismus železa u améb
Glavanakovová, Marie ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Pyrih, Jan (oponent)
Feritiny jsou proteiny s komplexní strukturou důležité pro skladování a detoxifikaci iontů železa. Typicky jsou lokalizovány v cytoplazmě buněk; nicméně byly identifikovány i v mitochondriích a chloroplastech. Feritiny jsou rozšířeny napříč organismy, ale nejsou běžné u nefotosyntetizujících protist. Z tohoto důvodu je překvapivá přítomnost genu pro feritin v genomu volně žijící améby Naegleria gruberi. Bioinformatická analýza potvrzuje jeho zařazení mezi eukaryotické feritiny. Protein byl lokalizován v mitochondriích N. gruberi pomocí protilátek vytvořených v laboratorním potkanovi. Nativní exprimovaný rekombinantní protein bez mitochondriální presekvence byl použit pro in vitro pokusy. Podařilo se nám prokázat pomocí růstových experimentů, že je exprese feritinu závislá na koncentraci iontů železa v médiu; nicméně přímo prokázat schopnost vazby iontů železa in vitro se nám nepodařilo. Funkce feritinu N. gruberi je tedy pravděpodobně spjatá s metabolismem železa. Vedlejší experimenty se zabývaly dalším proteinem patřícím do rodiny feritinů - Dps proteinem u Acanthamoeba castellanii. I přes úspěšné vytvoření protilátek jsme nedokázali tento protein detekovat v celkovém lyzátu ani ve frakcích acanthamoeb, a to ani po navození stresových podmínek.
|
|
|
Role of sulfhydryl oxidase 1 in cancerogenesis
Beranová, Lea Marie ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Cysteinové můstky hrají významnou roli při sbalování proteinů do nativní konformace, stejně jako v regulaci enzymové aktivity a účastní se tak mnoha intracelulárních, avšak i extracelulárních, dějů. Sulfhydryl oxidáza QSOX1 pomáhá tyto můstky de novo vytvářet čímž ovlivňuje aktivitu svých substrátů a přímo či nepřímo tím reguluje životně důležité procesy v buňce. Cílem této práce bylo prozkoumat roli QSOX1 v karcinogenzi a to především u buněk nádorů prsu (MCF7, MDA-MB-231) a slinivky břišní (Panc-1) a zároveň objasnit možnou spojitost mezi koncentrací kyslíku v rámci nádorového mikroprostředí a hladinou QSOX1 na proteinové i mRNA úrovni. Vytvořením dvou typů geneticky modifikovaných linií (QSOX1-overexprimující a QSOX1-knockout linie) byl pozorován pozitivní vliv QSOX1 na proliferaci trojnásobně negativních nádorových buněk MDA-MB-231. Buňky nevytvářející QSOX1 projevují nižší tendenci k proliferaci, zatímco nadbytek tohoto pro- teinu na tempo růstu vliv zdá se nemá. Nedostatek QSOX1 má také za následek viditelnou změnu v morfologii buňky, kdy dochází ke smrštění do kulovitějších útvarů s méně znatelnými lamelipodii, či jejich naprostou ab- sencí, což je v souladu s teorií důležitosti...
|
host ::
RSS.