|
|
Analýza změn genomu C. necator po evoluční adaptaci
Kroupa, Štěpán ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá analýzou mutačních změn bakteriálních populací Cupriavidus necator H16 po evoluci za různých stresových podmínek. Tato analýza byla provedena zpracováním dat z metody sekvenování genomu „Next Generation Sequencing“, která byla provedena externí společností DNALink. Na základě bioinformatického postupu byl sestaven seznam mutačních změn pro každou adaptovanou populaci. Dále byly stanovené mutační změny asociovány s konkrétními oblastmi referenčního genomu Cupriavidus necator H16 z NCBI a analyzovány dle dostupných informací. Na závěr byl diskutován případný vliv stanovených mutací na produkci zásobních polymerů polyhydroxyalkanoátů.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití různých metod izolace DNA baktérií mléčného kvašení v molekulárně biologických metodách
Chvalkovská, Eva ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předkládaná práce se zabývá probiotickými bakteriemi, izolací DNA z těchto baterií třemi různými metodami a vlivu izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. Probiotické bakterie jsou důležitou součástí trávícího traktu člověka. Mají důležitou roli pro funkci imunitního systému, a to díky adhezi na sliznici trávícího traktu, kde vytváří nehostinné prostředí pro patogeny. Probiotické baterie přijímáme běžně v potravě, ať už v mléčných výrobních nebo pomocí doplňků stravy. Díky nadužívání antibiotik ovšem hrozí riziko předání vnitřní rezistence, kterou probiotické bakterie mají kvůli udržení přirozené homeostáze trávícího traktu, patogenním bakteriím. Je tedy důležité efektivně identifikovat rizikové probiotické bakterie, které mají schopnost rezistenci přenášet a eliminovat tak jejich přítomnost v potravinách a potravinových doplňcích. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA, metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky. Přítomnost jednotlivých kmenů DNA v potravinových doplňcích byla potvrzena metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Jako nejlepší metoda izolace, co se týče čistoty a koncentrace izolované DNA byla na základě RT–PCR a spektrofotometrie vyhodnocena metoda izolace komerčním kitem.
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
|
|
|
Vliv přírodních látek z čaje na G-quadruplexy a vazebné a transaktivační vlastnosti proteinu p53
Foltanová, Klára ; Řeháková, Veronika (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Nádorový supresorový protein p53 patří mezi nejdůležitější regulátory buněčného cyklu při poškození DNA. Kromě zástavy buněčného cyklu a navození apoptózy, interaguje protein p53 s jinými proteiny a DNA. Mutace genu TP53 kódující protein p53 jsou společným znakem lidské rakoviny. Tato bakalářská práce zkoumá přírodní látky z čaje, které by mohly hrát pozitivní roli v aktivaci proteinu p53 u nádorových onemocnění a uplatnit se v podpoře léčby těchto onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byly popsány sekundární struktury DNA, konkrétně struktura a vlastnosti G-kvadruplexů, dále protein p53 a jeho vazebná aktivita k sekundárním strukturám DNA. Byly popsány vybrané přírodní látky vyskytující se v čajích a potravinách – kyselina gallová a apigenin. Cílem experimentální části této práce bylo ověřit schopnost těchto látek interagovat s G-kvadruplexy in vitro a tím je stabilizovat v kvasinkovém modelu a posoudit následný vliv na intenzitu účinku transkativace proteinu p53. Interakce kvartérních struktur s G4 ligandy byla ověřena in vitro pomocí ThT fluorescenčního testu a luciferázového reportérového testu. Bylo zjištěno, že G4 ligandy o koncentraci 30 M po 20 hodinách inkubace nevykazovaly výraznější vliv na testované kvasinkové kultury. Při koncentraci G4 ligandů 60 M bylo pozorováno navýšení produkce proteinu p53, vlivem buněčného stresu způsobeného přítomností G4 ligandů.
|
|
|
Rozvoj metod stanovení autenticity kosmetických výrobků s rostlinnou složkou
Langová, Denisa ; Brázda, Václav (oponent) ; Vorlová, Lenka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
V rámci disertační práce byly vyvíjeny metody pro stanovení autenticity kosmetických výrobků a potravin s rostlinnou složkou. Byla ověřena přítomnost přírodních složek v sérii modelových i komerčních kosmetických výrobků a byla ověřena i jejich autenticita. Těžištěm práce byl vývoj molekulárně-biologické metody pro účely detekce rostlinné složky (byliny, ovoce, silice) a probiotik přítomných v kosmetických výrobcích. Pro izolaci DNA z kosmetických přípravků byly použity komerčně dostupné izolační kity a metoda byla optimalizována pro izolaci rostlinné DNA ze vzorků kosmetických výrobků. Metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) byla detekována přítomnost rostlinné matrice v kosmetických výrobcích. Instrumentálními metodami byla detekována přítomnost vonných alergenů v kosmetických přípravcích. Byla zavedena metoda kvantifikace těchto alergenů pomocí kapalinové chromatografie a výsledky měření byly porovnány s výsledky plynové chromatografie s hmotnostní detekcí. Navržená metoda izolace a následné amplifikace rostlinné DNA je vhodná ke stanovení autenticity bylinných složek v kosmetických výrobcích. Navržená HPLC metoda je jednoduchá a levná metoda vhodná ke stanovení přítomných alergenů v množství nutném pro dodržení legislativy EU analytů a v požadované citlivosti (kromě hydroxycitronelalu). Obě metody lze využít i pro analýzu potravinářských výrobků.
|
|
|
Přítomnost a lokalizace lokálních DNA struktur v genomech papilomavirů
Vyoralová, Andrea ; Kollerová, Silvia (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Papilomaviry jsou pohlavně přenášené patogeny o délce genomu asi 8 kbp. Pravděpodobnost, že se dospělý člověk setká s nákazou papilomaviry je až 80–90 %. Ve většině případů se s infekcí vypořádá imunitní systém. U žen může však infekce vést až k rozvoji rakoviny děložního čípku. Tu způsobují vysoce rizikové lidské papilomaviry, proti nimž je dostupná vakcinace. V genomech papilomavirů byly nalezeny sekvence bohaté na guanin, ve kterých dochází k tvorbě G-kvadruplexů. Ty jsou tvořeny nad sebe naskládanými G-tetrádami a jsou stabilizovány monovalentními kationty, nejčastěji K+ a Na+. Nacházejí se například v telomerách, promotorech onkogenů, vazebných místech transkripčních faktorů a rekombinačních místech. V genomech těchto virů se rovněž nacházejí inverzní repetice (IR) složené ze sekvence nukleotidů, po níž následuje její reverzní komplement. Inverzní repetice se označují jako hotspoty genomové nestability, jelikož se skládají do vlásenkových nebo křížových struktur, které narušují replikaci DNA. K analýze genomů byl použit G4Hunter a Palindrome analyser. Analýzou bylo zjištěno, že výskyt potenciálních sekvencí tvořících G-kvadruplex (PQS) je vyšší v papilomavirech infikujících obratlovce než ve virech infikujících člověka, což je způsobeno vyšším obsahem guaninu a cytosinu, které bývají s tvorbou PQS spojovány. V genomech papilomavirů byla zjištěna vyšší frekvence výskytu PQS než u Archaea, Bacteria a Homo sapiens. Analýza IR prokázala, že je v genomech nejvyšší zastoupení nejkratších IR (6 bází) a také to, že IR o délce 25–30 bází se nachází pouze v několika málo genomech.
|
|
|
Study on the relation between G-quadruplexes and p53-driven regulation
Holotová, Paulína ; Vodička, Juraj (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
This thesis deals with the role of G-quadruplex structures, their stabilisation using ligands and the role of p53 in transcription regulation. G-quadruplex is a type of nucleic acid secondary structure composed of 2 – 4 tetrads. Each tetrad is formed by four guanines linked by Hoogsten base pairing. This work consisted of theoretical and experimental parts. The theoretical part described the nature of G-quadruplex structures and their potential for cancer treatment, the role of p53 in the cell cycle and its regulation, and the ligands curcumin and TMPyP4 used for G4 stabilization. In the experimental part, the interactions of the curcumin and TMPyP4 with nucleic acid structures were studied. Reporter yeast strains containing PUMA, KSHV, and their combinations were transformed with plasmids encoding only selection markers and plasmids encoding the wild type form of the gene for protein p53. In the viability assay, the optimal ligand (curcumin and TMPyP4) concentration was determined for reporter yeast strain PUMA, which was further used in Luciferase assay. A fluorescence indicator displacement assay with Thioflavin T as a fluorescence dye proved the interaction between G4-forming oligonucleotides, and curcumin and TMPyP4. Luciferase assay was used to evaluate the interaction between transformed reporter yeast strains and both ligands. The results after 24 hours showed statistical significance for each strain in the same environment, where the PUMA strain showed the highest transactivation activity: the PUMA insert is a target gene for p53. Sequences with both PUMA and KSHV showed significantly lower transactivation activity, as ligands may have stabilized the G4-structure present in KSHV and thus down- regulate transcription. The presence of G4 in the KSHV sequence was also confirmed using the G4Hunter, with a G4Score of 3.182. Transactivation was significantly lower in the PUMA strains present in curcumin and TMPyP4 environment, although this sequence was not predicted to form G4, which was also confirmed in the G4Hunter analysis. This suggests that studied ligands curcumin and TMPyP4 may regulate the cell metabolism in a different than previously predicted way.
|
|
|
Přítomnost a lokalizace lokálních DNA struktur v genomu Schizosaccharomyces pombe
Kubínová, Michaela ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Práce se zaměřuje na analýzu lokálních struktur DNA (křížových struktur a kvadruplexových struktur) v genomu Schizosaccharomyces pombe - kvasinky významné v potravinářském průmyslu. Přítomnost těchto struktur v DNA není náhodná. Na základě dříve provedených studií bylo zjištěno, že často kolokalizují s regulačními oblastmi genů a že úloha těchto sekundárních struktur v regulaci základních buněčných procesů (například replikaci či transkripci) je významná. Tato analýza byla provedena pomocí specializovaných bioinformatických nástrojů (G4Hunteru a Palindrome Analyseru), které mi umožnily tyto struktury identifikovat a následně analyzovat z hlediska jejich výskytu a lokalizace. V mtDNA bylo nalezeno mnohonásobně méně IR ve srovnání s výskytem IR v chromozomech. Bylo také zjištěno, že počet i frekvence PQS v mtDNA je velmi nízká. Od kvasinky S. cerevisiae se v tomto ohledu velmi liší. Dále bylo zjištěno, že počet nalezených IR se snižuje s rostoucí délkou IR a asi 17% IR nemá smyčku. Velké obohacení IR bylo zaznamenáno v oblasti repeat_region a rRNA, v případě PQS v oblasti rRNA a mRNA, tedy v sekvencích důležitých pro biologické procesy buňky.
|
|
| |
host ::
RSS.