|
|
Příprava kvasinkového systému pro studium lidské iniciace translace
Holásková, Lucie ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Cuchalová, Lucie (oponent)
Iniciace translace je vysoce regulovaný proces. Významnou roli v něm hraje komplex eIF4F, který se skládá z 3 podjednotek - eIF4A, eIF4E a eIF4G. Protein eIF4E se váže na 7-methylguanozinovou čepičku na 5' konci mRNA, helikáza eIF4A rozvolňuje sekundární struktury na mRNA a kostru tvoří protein eIF4G. Spolupráce s dalšími iniciačními faktory je důležitá pro zahájení tvorby proteinů. Cílem mé práce bylo přispět k vytvoření kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae s humanizovaným eIF4F faktorem. Nejprve jsem nahradila protein eIF4E kvasinky Saccharomyces cerevisiae za lidský protein eIF4E. S využitím delečních kazet a cre/loxP rekombinace jsem připravila kmeny s delecemi v genech eIF4GI (huΔ4G1) a eIF4GII (huΔ4G2). Charakterizace nově získaných kmenů překvapivě ukázala, že lidský eIF4E protein nahrazuje odpovídající kvasinkový orthologní faktor lépe než eIF4E z evolučně výrazně bližší Candida albicans. Pilotní pokusy s nově získanými kmeny a s kmeny závislými na eIF4E z Candida albicans též ukázaly na možný význam kvasinkového eIF4GII pro růst buněk během teplotního a osmotického stresu. Klíčová slova: iniciace translace, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
Vliv modifikací rRNA na syntézu proteinů
Kročová, Eliška ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Ribosom je supramolekulární útvar, který zprostředkovává syntézu veškerých buněčných proteinů a je tedy nezbytný pro její život. To, že jsou některé nukleotidy ribosomální RNA modifikovány je známo už čtyřicet let. Teprve v dnešní době se však daří hlouběji studovat, jak jsou jednotlivé modifikace syntetizovány i to, jaký je jejich vliv na vznik a funkci ribosomu. Některé konkrétní nukleotidové modifikace mají význam při vzniku ribosomu (například m1 acp3 Ψ1191 SSU), u některých byl pozorován vliv na správnou funkčnost ribosomu (například Um2921, Gm2922, Ψ2923 LSU, m1 acp3 Ψ1191 SSU). Většina modifikovaných nukleotidů v eukaryotní rRNA je rozpoznávána malými jadérkovými RNA (snoRNA). Několik málo nukleotidů je však rozpoznáváno a následně modifikováno specifickými proteiny. Tyto proteiny hrají i zásadní roli ve zrání ribosomu. Předložená práce přehledně shrnuje současné znalosti o úloze nukleotidových modifikací v ribosomální RNA při vzniku, zrání a funkci ribosomu.
|
|
| |
|
|
Protein synthesis in cellular stress
Cienciala, Martin ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Mnoho organizmů z různých větví života se často potýká s buněčným stresem zapříčiněným podmíkami vnějšího prostředí. Pro boj s těmito nepříznivými podmínkami se vyvinulo mnoho komplexních mechanismů. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae je obzvláště dobře vybavená pro eliminaci negativních účinků oxidativního nebo osmotického stresu. Tyto podmínky zpravidla vedou k zastavení produkce proteinů. Kináza GCN2 se považuje za hlavního zprostředkovatele této odpovědi. Zastavení produkce proteinů je také doprovázeno vyšší expresí proteinů, podílejících se na boji se stresem. Tvorbě těchto proteinů předchází sada specializovaných regulačních procesů, fungujících na různých stupních proteinové exprese. Tato práce se pokusí přednést rozmanitost a komplexitu jednotlivých úrovní této regulace.
|
|
|
Role signální dráhy HOG MAPK při osmotickém stresu u Saccharomyces cerevisiae
Vrbová, Michaela ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
THE ROLE OF HOG MAPK SIGNALING PATHWAY DURING OSMOTIC STRESS IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells utilize a conserved mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascade (the high- osmolarity glycerol or HOG pathway) during conditions of increased external osmolarity. It evokes cellular responses necessary to permit continued growth. Activation of HOG pathway with Hog1 MAP kinase results in production of glycerol to prevent dehydration and up regulation of other Hog1 dependent genes because of cell adaptation. We were trying to find difference in translation between wild-type cells and two mutants of hog1 gene before and after 0,4 M NaCl osmotic stress (2, 6, 30 min). We used deletion mutant hog1Δ and hog1-as mutant with point mutation which allows inhibition of Hog1 MAPK during presence of specific AS inhibitor. We tested AS inhibitor by plate test and have found optimal concentration of 5 μM for blocking Hog1 MAPK in hog1-as mutant. Translation profiling proves that osmotic stress decreases translation in general. Hog1Δ mutant and hog1-as AS inhibited mutant behave similarly and their translation recovers slower than the wild-type's. That confirms that HOG1 gene is important for cell recovery from the osmotic stress. Microarray analysis shows that Hog1 dependent...
|
|
|
Role of the oncogenic microRNAs miR-17-92 and miR-155 in the regulation of hematopoietic differentiation and leukemogenesis
Pospíšil, Vít ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Machová Poláková, Kateřina (oponent)
Krvetvorba je vysoce uspořádaný hierarchický proces, ve kterém je diferenciace specializovaných krevních buněk závislá na koordinované regulaci genové exprese dvěmi klíčovými regulátory: transkripčními faktory a mikroRNA. PU.1 je základní transkripční faktor nezbytný pro vývoj a diferenciaci kmenových a progenitorových buněk do myeloidní a lymfoidní krevní řady. MikroRNA jsou nekódující ~22 nukleotidů dlouhé RNA, jež regulují posttranskripčně genovou expresi vazbou do nepřekládané oblasti mRNA a tím způsobují umlčení translace. Předložená disertační práce popisuje nové mechanismy vzájemné regulace a funkce onkogenních mikroRNA, miR-17-92 klastru a miR-155 a transkripčních faktorů PU.1 a Egr2, účastnících se makrofágové diferenciace myeloidních progenitorů. MiR-17-92 (Onkomir1) kóduje sedm příbuzných mikroRNA, které regulují buněčnou proliferaci, apoptózu a vývoj, které jsou nadprodukovány v nádorových buňkách myeloidních leukemií a dalších malignit. Tato práce popisuje nový mechanismu regulace miR-17-92 klastru v myeloidních progenitorech. V průběhu makrofágové diferenciace transkripční faktor PU.1 indukuje expresi sekundárního transkripčního faktoru Egr2. Ten se váže do CpG ostrůvku v promotorové oblasti miR-17-92 klastru a současně přináší protein Jarid1b, histon demetylázu, jež demetyluje...
|
|
|
Interakční partneři proteinu eIF4E2 v lidských buňkách
Pospíšilová, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Protein eIF4E2 patří do rodiny eukaryotních translačních iniciačních faktorů 4E, za běžných okolností se ale iniciace translace neúčastní. Jeho hlavní úloha spočívá v represi translace specifických mRNA. Přesto se v podmínkách hypoxie eIF4E2 účastní iniciace translace jako podjednotka specific- kého translačního iniciačního komplexu. Přesný mechanismus působení eIF4E2 ani v jednom z procesů není znám. Jedním ze způsobů, jak roli eIF4E2 v buňce prostudovat, je zjistit, s jakými dalšími proteiny eIF4E2 interaguje. Cílem práce bylo vyhledat pomocí imunoprecipitace následované hmotnostní spek- trometrií potenciální interakční partnery eIF4E2 v buňkách linie HEK293. Kromě individuálních pro- teinů bylo cílem také identifikovat proteinové komplexy, jejichž součástí je v buňkách linie HEK293 faktor eIF4E2. Druhým směrem práce byla příprava systému pro hledání inhibitorů interakce eIF4E2 s eIF4G3. Hlavním výsledkem práce je nalezení potenciálních nových interakčních partnerů eIF4E2 v lidských buňkách.
|
|
|
Nekanonické funkce IL-1α
Novák, Josef ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Brdička, Tomáš (oponent)
1α (IL 1α) je cytokin s lépe prozkoumaná role IL 1α spouštění prozánětlivé signalizace skrze membránový receptor, ta však není předmětem této práce. terminální oblast IL 1α sice neváže receptor, ale je evolučně konzervovaná uděluje IL 1α řadu nekanonických funkcí, kterým se tato práce věnuje 1α 1α asociovat s membránami. Jaderně lokalizovaný IL 1α je terminální doménu schopný aktivovat expresi prozánětlivých genů řízených transkripčním faktorem NF κB, vázat se na histonac rázové komplexy a v rakovinných buňkách vyvolávat apoptózu. V kvasinkách byla nalezena vazba na katalytický modul histonacetyltransferázových komplexů SAGA a ADA, v lidských buňkách na komponenty homologního komplexu STAGA a Ukotvení I 1α N terminální doménou na membránu buněk slouží k prostorové lokalizaci signalizace tohoto cytokinu pouze na buňky v bezprostředním dotyku. tečně prozkoumán ani mechani mus přesunu IL 1α přes membránu, ani mechani mus kotvení 1α. Tato práce se věnuje oběma zmíněným nekanonickým funkcím. V kvasinkách popisuje 1α částečně zastoupit derepresivní funkci proteinu Snf1 na genech reprimov ných SAGA komplexem, v lidských buňkách popisuje vazbu IL 1α na nádorový supresor p53 podmínkách genotoxického stresu. V podmínkách oxidativního stresu s 1α přesunuje exinem A2, proteinem vázajícím membrány, na buněčné periferie.
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
| |
host ::
RSS.