|
|
Exprese CD47 a jeho topologie na povrchu primárních buněk karcinomu močového měchýře při interakci s makrofágy
Rajtmajerová, Marie ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
CD47 je tak zvaný "don't-eat-me" signál, který chrání buňky před fagocytózou. Jeho zvýšená exprese na nádorových buňkách otevírá novou možnost pro protinádorovou terapii. Monoklonální protilátky, které jsou dnes v klinických testech, blokují vazbu CD47 k inhibičnímu receptoru SIRPA na povrchu makrofágů, a tím zvyšují jejich fagocytickou funkční kapacitu. Proto umožňují pohlcení fagocytózou a následnou likvidaci nádorových buněk. To, zda bude buňka zlikvidována, závisí na úrovni celkové exprese, strukturní konformaci a stechiometrii CD47. Cílem mé diplomové práce je testování a příprava metod pro zmapování expresních parametrů CD47 metodou průtokové cytometrie (FCM), kvantitativní PCR (qPCR) a mikroskopie. K dosažení tohoto cíle jsem porovnala detailní vazebné vlastnosti komerčně dostupných protilátek v kompetičních testech na buněčných liniích. Po provedení tSNE analýzy jsem porovnala expresi CD47 s expresí dalších povrchových receptorů na primárních buňkách pacientů s karcinomem močového měchýře. Zde jsem se zaměřila na expresi CD47 v rámci diferenciačního kontinua nádoru. Abych lépe porozuměla vztahu mezi expresí CD47 a diferenciačním stádiem nádorové buňky, provedla jsem qPCR a porovnala expresi CD47 s vybranými transkripčními faktory. Následně jsem u dvou vybraných buněčných linií ověřila...
|
|
|
Human lymphopoiesis and its examination via single-cell analysis
Novák, David ; Kalina, Tomáš (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Vývoj lidských B-lymfocytů je spletitým dějem. Samoobnovující se kmenový progeni- tor v primární lymfoidní tkáni je nejdříve předurčen k vývoji v lymfoidní linii. Vývoj B-buněčnou cestou pak zahrnuje somatické genové rekombinace, které vedou k expresi povrchového antigenního receptoru. Funkčnost B-buněčného receptoru a podrobení buňky testování na autoreaktivitu jsou podmínkami pro diferenciaci ve zralý B-lymfocyt. Děje v rámci tohoto vývoje jsou často zkoumány pomocí single-cell analýzy skrze průtokovou cy- tometrii, fluorescencí aktivované třídění buněk a hmotnostní cytometrii. Propojení těchto vysoce výkonných metod s moderními přístupy k analýze dat skýtá obrovský potenciál v nacházení vzácných buněčných populací a odchylných událostí v rámci krvetvorby. Klíčová slova: B-lymfocyt, lymfopoéza, průtoková cytometrie, FACS, hmotnostní cy- tometrie, shluková analýza, FlowSOM, PCA, t-SNE, Wanderlust. 1
|
|
| |
|
|
Imunogenní buněčná smrt v klinických vzorcích nádorů
Fejfarová, Adéla ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Büchler, Tomáš (oponent)
Růst a vývoj nádoru je v lidském organismu pod kontrolou imunitního systému. Za spuštění protinádorové imunitní odpovědi jsou zodpovědné molekuly DAMP ("danger-associated molecular pattern"), které se váží na PRR ("pattern recognition receptors") receptory buněk přirozené imunity, což následně vede k aktivaci imunity adaptivní. K uvolnění DAMP molekul z nádorových buněk dochází během imunogenní buněčné smrti (ICD, "immunogenic cell death"). ICD je jedním z typů regulované buněčné smrti (RCD, "regulated cell death"). V experimentálních podmínkách je ICD vyvolaná řadou terapeutických postupů běžně používaných pro léčbu pacientů s nádorovými onemocněními. Charakteristickým znakem ICD je DAMP molekula proteinu kalretikulin, který se přesouvá z endoplazmatického retikula na povrch buněk, kde je ukotvený pomocí receptoru CD91. Mezi další znaky patří jaderný protein HMGB1, který se v pozdní fázi ICD uvolňuje z buněk do nádorového prostředí. Tato bakalářská práce popisuje metody využívané pro detekci externalizace těchto DAMP molekul, a to jak v experimentech s buněčnými liniemi, tak především u vzorků nádorů z pacientů. Dále popisuje vliv těchto DAMP molekul na dobu přežití pacientů. Shrnuje také aktuální stav klinických studií zabývajících se tématem ICD. Klíčová slova nádor, protinádorová imunita,...
|
|
|
Generation and analysis of mutant mouse model to study roles of KLKs in cutaneous inflammation
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Kallikreinové peptidázy (KLKs) jsou podskupinou serinových proteáz se zásadní důležitostí pro řadu funkcí, jejichž dysregulace přispívá k řadě patologických fenotypů. Nethertonův syndrom zaujímá mezi těmito patologiemi zásadní postavení, jelikož deregulace kallikreinových proteáz hraje klíčovou roli, především KLK5, KLK7 a do menší miry také KLK14. V případě této patologie je narušen gen hlavního regulačního proteinu těchto proteáz v kůži, kterým je SPINK5. To vede k nekontrolované hyprreaktivitě těchto proteáz a následnému narušení epidermální bariéry díky nadměrné epidermální deskvamaci a vážnému zánětu kůže. Zánětlivé mechanismy Nethertonova syndromu jsou v tuto chvíli relativně málo objasněné a panuje přesvědčení, že hlavní roli hraje zpracování imunitních molekul pomocí těchto proteáz a dysregulace kožního mikrobiomu. TNFα signalizace hraje klíčovou roli v imunitní odpovědi proti mikrobům a chronické kožní záněty mohou vest k závažným zdravotním stavům, ve kterých je TNFα důležitým komponentem. Abychom adresovali vliv TNFα signalizace v kontextu kallikreinových proteáz a Nethertonova syndromu, tak jsme vytvořili myší model, ve kterém je narušen gen Tnfr1 kódující protein receptor TNFR1 na pozadí již vytvořených modelů Nethertonova syndromu. Úspěšně jsme vytvořili Tnfr1-/- myší model a následně...
|
|
|
Activation and regulation of cell death in senescent cancer cells.
Holíček, Peter ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Bunková senescencia je špecifický bunkový stav charakteristický zastavením proliferácie, sprevádzaný typickými morfologickými a biochemickými zmenami. Narastajúci a pretrvávajúci výskyt senescentných buniek v organizme sa ukázal ako škodlivý a prispievajúci k jeho starnutiu. Senescentné bunky podporujú rast nádoru a dokonca aj stimulujú nádorovú transformáciu. Senescencia môže byť navyše indukovaná aj v samotných nádorových bunkách a to napríklad spontánne alebo chemoterapiou. Vzhľadom na prvotný stimul a na druh buniek, existujú dve hlavné senescenciu-indukujúce signálne dráhy sprostredkované proteínami p16/Rb a p53/p21. Senescentné, tak ako aj rakovinné senescentné bunky, sa zdajú mať pozmenené apoptotické signálne dráhy na úrovni mitochondrií a proteínov rodiny Bcl-2. V tejto štúdii sme sa zamerali na analýzu vplyvu senescentného a pre-senescentného (v proliferácii zastaveného) stavu v klonálnych kultúrach mezoteliomálnej rakovinnej línie H28, indukovaného buď signálnou dráhou p16/Rb alebo p53/p21 na odpoveď voči smrť- indukujúcim stimulom. Prostredníctvom doxycyklín-závislej inducibilnej expresie proteínov p16 a p21 sme bunkám navodili senescencii-podobný fenotyp, ktorý sme podrobne charakterizovali. Zdokumentovali sme, že p16-exprimujúce bunky získajú slabší senescencii-podobný fenotyp,...
|
|
|
Imunogenita indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC)
Tejklová, Tereza ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Hájková, Michaela (oponent)
Ektopickou expresí vybraných transkripčních faktorů jsme dnes schopní dediferencovat somatické buňky do stádia indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC), které se staly prostředkem pro regenerativní medicínu a personalizované modelování onemocnění včetně diagnostických nástrojů. Unikátní vlastností iPSC je tvorba pacientovi vlastních autologních buněk, které nebudou aktivovat jeho imunitní systém při terapeutickém použití. Ukazuje se však, že imunogenita se nevyhýbá ani těmto autologním iPSC. iPSC typicky exprimují sníženou hladinu MHC glykoproteinů I. třídy a tím přímo aktivují NK buňky přirozené imunity. T buňky, které jsou součástí adaptivní imunitní odpovědi, jsou aktivované po rozpoznání antigenního peptidu nebo MHC I dárce pouze ve spolupráci s kostimulačními signály, které se na iPSC zpravidla neexprimují. Během diferenciace si iPSC zachovávají epigenetický profil zdrojové buňky, který se projeví abnormální expresí genů buněčných linií. Výsledná imunogenita závisí také na metodě přípravy iPSC, která může narušit genomovou stabilitu buňky. Dalším kritickým faktorem je konkrétní imunitní prostředí místa pro transplantaci a poškození tkáně při podání, které se projeví vylitím "danger associated molecular pattern" (DAMP), které jsou rozeznané "pattern recognition receptors" (PRR) na...
|
|
|
Imunogenní buněčná smrt
Šímová, Michaela ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Javorková, Eliška (oponent)
Imunitní systém je podle "danger" modelu aktivovaný endogenními molekulami uvolněnými z umírajících buněk, které v extracelulárním prostředí slouží jako signály nebezpečí. Jedná se o takzvané DAMP ("danger-associated molecular pattern") molekuly. Nekrotická smrt a prozánětlivé typy programovaných buněčných smrtí charakterizované porušením plazmatické membrány jsou považované za imunogenní, zatímco apoptóza byla původně definovaná jako tolerogenní typ smrti. Za některých okolností však může být imunitní odpověď iniciovaná i apoptotickou buňkou, která je schopná externalizovat DAMP molekuly nově popsanými sekrečními drahami. Tento jev byl pozorovaný na nádorových buňkách jako následek některých široce používaných terapeutických postupů a byl nazvaný imunogenní buněčná smrt ("immunogenic cell death" - ICD). Součástí této práce je nomenklatura vybraných typů buněčné smrti. Cílem této bakalářské práce je poskytnout evidenci o stávajících experimentálních důkazech, které podporují teorii ICD při vyvolání imunitní odpovědi in vivo. Dále zhodnotím často používanou korelaci s objevením typických DAMP molekul na povrchu nádorových buněk či sekrecí těchto molekul do extracelulárního prostředí.
|
|
|
Detekce povrchového fenotypu a chemosenzitivity buněk nádorů močového měchýře in vitro
Šímová, Michaela ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Vondálová Blanářová, Olga (oponent)
Nádorová onemocnění jsou celosvětově druhou nejčastější příčinou úmrtí. Jedním z důvodů selhávání onkologické léčby jsou jednotně nastavené terapeutické postupy zanedbávající vliv vysoké heterogenity nádorů. Eseje chemosenzitivity a rezistence (CSRA) stratifikující pacienty před zahájením terapie jsou dlouhodobě zvažovanou metodou pro personalizaci výběru složek léčebné směsi chemoterapeutik. Žádná z vyvinutých CSRA esejí ovšem doposud nedosáhla rutinního klinického využití. Určitá chemoterapeutika využívaná pro svůj cytotoxický a cytostatický efekt jsou zároveň schopná indukovat v nádorových buňkách takzvanou imunogenní buněčnou smrt (ICD), a tím aktivovat imunitní odpověď cílenou proti nádorovým buňkám. Souběžné sledování změn exprese molekul asociovaných s regulací přirozeného imunitního systému na povrchu umírajících nádorových buněk by umožnilo predikovat schopnost pacienta reagovat na léčbu zahrnující moderní imunoterapeutika. V této práci je kriticky zhodnocena proveditelnost CSRA pomocí průtokové cytometrie a mikroskopie na modelu karcinomu močového měchýře. Zároveň je diskutována korelace imunogenního fenotypu nádorových buněk s jejich citlivostí na vybraná chemoterapeutika.
|
|
|
Fibroblast activation protein and local immunosuppression in glioblastoma
Ternerová, Nikola ; Stollinová Šromová, Lucie (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Glioblastomy (GBM) jsou jedním z nejčastějších maligních nádorů v centrální nervové soustavě. Mikroprostředí GBM obsahuje maligní a nemaligní stromální buňky, jejichž vzájemné interakce přispívají k řadě charakteristik GBM, včetně aberantní angiogeneze, vysoké rychlosti proliferace a systémové a lokální imunosuprese. Fibroblastový aktivační protein α (FAP) je membránová serinová proteáza, která je minimálně exprimována ve zdravých tkáních, ale je upregulována u solidních nádorů, včetně GBM. FAP může být v nádorovém mikroprostředí exprimován maligními i stromálními buňkami, přičemž jeho exprese ve stromálních buňkách je často spojena s narušenou protinádorovou imunitní odpovědí. Význam FAP a FAP exprimujících stromálních buněk v infiltraci imunitních subpopulací do mikroprostředí GBM není jasný. Tato diplomová práce se zaměřila na vývoj postupu využívajíciho průtokovou cytometrii k identifikaci subpopulací imunitních buněk přítomných v nádorovem mikroprostředí v modelu syngenního glioblastomu u myší divokého kmene a myší s genovou inaktivací FAP. Byly vyhodnoceny čtyři metody kombinující mechanickou a enzymatickou disociaci z hlediska jejich schopnosti zachovat životaschopnost buněk a expresi studovaných povrchových molekul s použitím nenádorové tkáně a tkáně myšího GBM. Jako nejvhodnější metodu pro...
|
host ::
