|
|
Mechanism of regulation of EGFR receptor ligand activation via the intramembrane pseudoprotease iRhom and cell surface metalloprotease ADAM17
Trávníčková, Květa ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalisace skrz receptor pro epidermální růstový faktor (EGF receptor, EGFR) podléhá propracované a mnohovrstevné regulaci. Jedním ze způsobů vylaďování signalisace zprostředkované tímto receptorem je kontrola produkce jeho ligandů. U savců za uvolňování solubilních, biologicky aktivních forem ligandů EGF receptoru zodpovídají především metaloproteasy ADAM10 a ADAM17. Pseudoprotease iRhom z rodiny rhomboid-like proteinů byla nedávno připsána úloha klíčového positivního regulátora ADAM17. U drosofily však je iRhom spjat s negativní regulací EGF receptoru, a to prostřednictvím degradace prekursorů jeho ligandů. Experimenty prováděné v savčích buněčných kulturách ovšem naznačují, že podobná funkce by mohla být zachována i u savčích iRhomů. V této diplomové práci byl studován vliv overexprese iRhomu na expresní úroveň ligandů EGF receptoru. Na rozdíl od dřívějších publikací však nebylo potvrzeno, že by pozorovaný efekt bylo možno vysvětlit výlučně přítomností iRhomu, neboť neaktivní mutanti rhomboidních proteas jej působili rovněž. Také nebylo prokázáno, že by iRhom takto ovlivňoval pouze ligandy EGF receptoru - strukturně podobné, avšak ligandům EGF receptoru nepříbuzné proteiny v přítomnosti iRhomu taktéž podléhaly depleci. Koexprese ADAM17 mizení ligandů EGF receptoru zamezila, avšak pouze v...
|
|
|
Proximity proteome of intramembrane serine protease RHBDL4
Boháčová, Šárka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Intramembránová proteolýza je součástí celé řady buněčných drah a procesů. Je katalyzována specializovanými enzymy - intramembránovými proteázami (IMPR), které svůj substrát štěpí v rámci jeho transmembránové domény pod povrchem membrány. Rhomboidní proteázy jsou serinové IMPR. Vyskytují se napříč celým spektrem živých organismů a co do transmembránové topologie a sekvenčních motivů jsou evolučně konzervovány. Avšak navzdory dlouhodobé snaze, fyziologickou úlohu většiny rhomboidních proteáz doposud neznáme. RHBDL4 je savčí rhomboidní proteáza nacházející se v endoplasmatickém retikulu. Podílí se na vzniku kolorektálního karcinomu, což podtrhuje význam jejího studia. Fyziologická úloha RHBDL4 je však převážně neobjasněna. Za účelem jejího hlubšího prozkoumání jsem zavedla a následně aplikovala metodu proximitní proteomiky označovanou APEX2. Je založena na značení proteinů v blízkosti vybraného cíle biotinem, a to ve fyziologickém prostředí živých neporušených buněk. Značené proteiny jsou následně izolovány a detekovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Analýzou proximitního proteomu proteázy RHBDL4 je možné odhalit její interakční partnery, substráty či lépe definovat konkrétní podoblast ER, kde se vyskytuje. V rámci tří nezávislých experimentů v buněčné linii HCT116 se tři proteiny opakovaně...
|
|
|
Development of inhibitors of rhomboid proteases as tools for the study of their biological functions
Tichá, Anežka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Rhomboidy jsou serinové membránové proteasy, které patří do evolučně rozšířené rodiny rhomboidních proteinů. Rhomboidy si ve srovnání s klasickými serinovými proteasami vyvinuly odlišný katalytický mechanismus; místo běžně triády (Ser/His/Asp) k proteolýze využívají pouze katalytickou dyádu (Ser/His) a jejich aktivní místo se nachází uvnitř lipidové membrány, což - společně s faktem, že jsou hydrofobní - komplikuje jejich studium. Přestože je známé jejich zapojení v mnoha důležitých biologických procesech, stále u většiny rhomboidů není jasný konkrétní mechanismus, kterým přispívají k regulaci těchto procesů nebo k patologickým projevům souvisejících onemocnění (jako např. malárie, Parkinsonova choroba nebo rakovina). Pochopení těchto dějů je ztíženo nedostatkem nástrojů k jejich studiu jak in vitro, tak in vivo. Ve své práci uvádím nové fluorogenní substráty založené na Försterově rezonančním přenosu energie (FRET) a odvozené od sekvence LacYTM2, které umožňují široké využití pro kontinuální sledování aktivity mnoha rhomboidů in vitro. Modifikacemi v P5-P1 pozicích je možné zvýšit specifitu substrátu k cílovému rhomboidu, zatímco výběr FRET páru fluoroforů absorbujícího v červené oblasti viditelného světla umožňuje jejich využití pro rychlé testování knihoven molekul. Selektivní a účinné...
|
|
|
Význam S1 podmísta intramembránových proteas z rodiny rhomboidů pro katalýzu a návrh inhibitorů
Kučerová, Jolana ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá vývojem specifických inhibitorů intramembránových proteas z rodiny rhomboidů. Tyto inhibitory jsou potřebné pro buněčně biologické studium rhomboidových proteas i jejich potenciální farmakologické zacílení. Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou spojovány s různými onemocněními, jako například malárií, Parkinsonovou chorobou, rakovinou, či toxoplazmózou. Laboratoř školitele nedávno objevila první skupinu takovýchto inhibitorů, peptidyl ketoamidy. Pro jejich plné využití je nutné vlastnosti a možnosti modifikace těchto látek blíže prozkoumat. Cílem této práce bylo prostřednictvím syntetických fluorogenních substrátů a enzymové kinetiky ověřit možnosti využití S1 podmísta v aktivním místě rhomboidu pro návrh inhibitorů se zvýšenou účinností a selektivitou, a také pomocí variant substrátů se záměnami v P1 pozici za nepřirozené aminokyseliny prozkoumat mechanismus transferu vody do aktivního místa rhomboidové proteasy. Ze srovnání rychlosti štěpení deseti fluorogenních substrátů s modifikací v P1 pozici rhomboidem GlpG z E. coli bylo zjištěno, že nejlépe přijímané postranní řetězce aminokyselin v P1 pozici (vážící se do S1 podmísta) jsou pro GlpG -CH2-CH3 a -CH3. Tento trend se potvrdil i u peptidyl ketoamidových inhibitorů. Ze studia substrátů a inhibitorů...
|
|
|
Intramembránové proteázy a jejich medicínský význam
Deylová, Anna ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
Intramembránové proteázy jsou membránové enzymy, které mají aktivní místo zanořeno pod povrch buněčné lipidové membrány a které štěpí ostatní membránové proteiny uvnitř jejich transmembránových domén. Podle svého katalytického mechanizmu se dělí na celkem čtyři rodiny - aspartátové, serinové (často nazývané rhomboidy), metaloproteázy a nejnověji popsané glutamátové. Štěpením uvnitř lipidové dvojvrstvy ovlivňují mnoho biologicky významných dějů jako je metabolizmus lipidů, buněčná proliferace či adheze, regulace vývojové signalizace, degradace signálních peptidů a obecně kontrola kvality membránových proteinů. Tato práce se zaměřuje především na jejich roli v různých původcích onemocnění a biologických mechanizmech spojených s patologickými ději. Jedná se především o Alzheimerovu chorobu, infekci jednobuněčnými parazity (Mycobacterium tuberculosis, Entamoeba histolytica a Plasmodium falciparum), maturaci viru hepatitidy C, Bunyamwera viru a viru prasečí chřipky a mitochondriální dysfunkce.
|
|
|
Evoluce regulačních mechanismů aktivace EGF receptoru
Trávníčková, Květa ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Koudelková, Lenka (oponent)
Signalisace prostřednictvím EGF receptoru je klíčová pro správný průběh ontogenetického vývoje i udržování homeostasy v tělech organismů. Jsou skrze ni regulovány procesy jako proliferace, migrace či diferenciace buněk. Na příkladu tří dobře probádaných organismů, C. elegans, D. melanogaster a H. sapiens sapiens, jsou v této práci vyloženy principy regulace EGF receptoru a na jejich základě poté vyvozeny trendy, které se při jejich evoluci uplatnily. Zvláštní pozornost je přitom věnována proteinům z rodiny rhomboidů, jejichž činnost je se signalisací EGF receptoru pevně spjata. Narušení regulace EGF receptoru významně přispívá k projevům některých onemocnění, předně mnohých typů rakovin, ale také schizofrenie, lupénky a kardiovaskulárních chorob. Proto mají výsledky výzkumu na tomto poli potenciál uplatnit se při vývoji nových léčebných prostředků.
|
|
|
Zkřížená prezentace antigenů - mechanismus a biologický význam
Boháčová, Šárka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
ii Abstrakt Zkřížená prezentace antigenů je proces, kdy dendritické buňky předkládají antigeny zvenčí CD8+ T lymfocytům na MHC-I glykoproteinech. Jako zkřížená se označuje proto, že oproti cestám klasické prezentace vede vskutku křížem, protože vnější antigeny jsou zpravidla prezentovány na MHC-II a vnitřní na MHC-I glykoproteinech. Molekulární mechanismus zkřížené prezentace doposud není uspokojivě objasněn. Uvažují se dvě hlavní cesty - vakuolární a cytosolická. Vakuolární cesta předpokládá, že pohlcené antigeny jsou naštěpeny v endosomu pomocí proteáz a následně naloženy na MHC-I. Cytosolická cesta předpokládá, že pohlcený antigen proniká z váčku do cytosolu, kde je naštěpen v proteazomu. Odtud putuje buď do endoplasmatického retikula (ER), kde je MHC-I naloženo i při klasické prezentaci antigenu, nebo zpět do endosomu, kam se mašinérie nakládající MHC-I přesouvá. Procesu se účastní proteiny z ER, včetně těch, které spolupracují na mechanismu ERAD, Rab GTPázy regulující váčkový transport a struktury podílející se na maturaci endosomů. Zkřížená prezentace má svůj význam z medicínského hlediska, jelikož aktivuje CD8+ T lymfocyty proti intracelulárním patogenům a rakovinným buňkám a také navozuje toleranci na periferii. ...
|
|
|
Analysis of substrate specificity and mechanism of GlpG, an intramembrane protease of the rhomboid family.
Peclinovská, Lucie ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Proteiny z rodiny rhomboidů jsou široce konservované v evoluci a obsahují dvě velké podskupiny, proteolyticky aktivní intramembránové proteasy serinového typu (rhomboidy) a rhomboidům podobné proteiny, které během evoluce ztratily proteolytickou aktivitu, ale zachovaly si schopnost vázat membránový helix jiných proteinů. Zástupci obou těchto skupin hrají významnou roli v celé řadě biologických procesů, jako například v buněčné signalizaci, v mechanismech podílejících se na kontrole kvality sbalení proteinů v endoplasmatickém retikulu, v mitochondriální dynamice a také v hojení ran. Ačkoliv medicinský potenciál proteinů z rodiny rhomobidů vzrůstá, pochopení strukturní podstaty jejich funkce pokulhává. Hlavním strukturním a mechanistickým modelem pro pro rodinu rhomboidů a vlastně pro intramembránové proteasy obecně se stal rhomboid GlpG z E.coli, který byl první intramembránovou proteasou jejíž rentgenová struktura byla vyřešena. Substráty GlpG jsou membránové proteiny s jedním transmembránovým helixem a ke štěpení dochází v jejich transmembránové části, ale mechanismus vazby substrátu na enzym ani podstata substrátové specifity nejsou plně pochopeny. Tato práce se zabývá charakterizací významu transmembránové domény substrátu pro jeho rozpoznání proteasou GlpG a využívá hlavně enzymové kinetiky a...
|
|
| |
host ::
RSS.