|
|
Charakterizace integrálních membránových peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie
Sabó, Ján ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
Biologické membrány zabezpečují v živých organismech velkou škálu životně důležitých procesů. Složení lipidů i proteinů v biologických membránách je velmi komplexní. Pro chápání bazálních membránových mechanismů je proto nutné využívat zjednodušené modely in vitro. Transmembránové proteiny I. a II. druhu je možné nahradit krátkými, α-helix tvořícími, syntetickými peptidy. Hydrofobní charakter peptidů a jejich pozice v membránách dobře reprezentuje transmembránové domény proteinů v živých organismech. Mezi jedny z nejjednodušších a nejhojněji využívaných modelových membránových systémů patří liposomy. Metody pro jejich formaci jsou známé již dlouhou dobu, ale kvantifikace jednotlivých složek liposomů po jejich zformování není úplně snadná. Je však velmi žádaná, pro zachování maximální kontroly nad daným modelovým systémem. V této práci byla adaptována metoda pro delipidizaci transmembránových peptidů, které byly následně charakterizovány pomocí LC/MS. Relativní množství peptidu, jenž se nachází ve vezikulách po jejich formaci, bylo získáno zpracováním extrahovaných chromatogramů pro ionty peptidu. Zjistili jsme, že touto metodou je možné relativně přesně charakterizovat proteo-lipidové vezikuly s obsahem peptidů 5-10 mol%. Ztráty peptidu při inkorporaci nepřesahují 50 % a mohou být použity pro...
|
|
|
The effect of peptides derived from protein transmembrane domains on membranes
Olšinová, Marie ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vácha, Robert (oponent)
Složitá struktura buněčných membrán vyvolává mnoho otázek týkajících se mechanismu procesů relevantních pro správnou funkci membrán. Dizertační práce představuje čtyři články zabývající se organizací lipidových membrán a interakcemi mezi lipidy a peptidy. Experimenty byly prováděny na modelových lipidových membránách. Tyto zjednodušené systémy napodobující buněčné membrány umožňují studium protein-lipidových interakcí na molekulární úrovni a studium fyzikálně-chemických vlastností membrán kontrolovaným způsobem. Pro charakterizaci systému byly použity pokročilé fluorescenční techniky jako FCS, TDFS, FLIM a anizotropie. První publikace popisuje nově navržené fluorescenční značky založené na struktuře boron dipyrromethenu, tzv. molekulární rotory, které jsou využívány jako sondy pro měření viskozity. Podrobná analýza doby života excitovaného stavu molekulárních rotorů zanořených do lipidových membrán ukázala na různou inkorporaci jednolivých značek do membrány a na změnu orientace fluoroforů v membránách o různé rigiditě. Druhá část práce se zabývá studiem vzniku lipidových nanodomén v membráně v přítomnosti cross-linkeru. Přestože standardní fluorescenční mikroskopické techniky neumožňují přímou vizualizaci nanodomén, jejich existenci jsme byli schopni detekovat pomocí FCCS a FLIM-FRET technikami....
|
|
|
Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Transportéry plasmatické membrány kvasinekhrají důležitou úlohu v mnoha buněčných dějích. Mezi tyto děje patří například detoxikace a budování a udržování membránového potenciálu (ΔΨ). Metoda využívající fluorescenční sondu diS-C3(3) vyvinuta na Oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy nám umožnila pohodlně studovat obojí a je zároveň vhodným nástrojem pro sledování změn těchto důležitých parametrů. Mnohé studie jak na živočišných buňkách, tak i na kvasinkách, ukázali, že etanol a jiné alkoholy inhibují funkci různých membránových kanálů, receptorů a specifických transportérů. Jako mechanismus účinku byla uvažována přímá interakce alkoholů s těmito membránovými proteiny. V naší studii jsme pro identifikaci inhibitorů pump mnohočetné lékové rezistence použili metodu s fluorescenční sondou diS-C3(3) a sadu kvasinkových kmenů s delecí genů PDR5 a SNQ2. Zjistili jsme, že pumpy kódované těmito dvěma geny jsou inhibovány n-alkoholy (od etanolu po hexanol). Ukázali jsme, že inhibiční účinek roste s délkou uhlovodíkového řetězce alkoholů, nesouvisí s poškozením plasmatické membrány a je plně revezibilní. Tyto zjištění napovídají, že studovaný inhibiční účinek nemusí nutně zahrnovat jenom změny lipidové matrice plasmatické membrány, ale může být způsoben také přímou interakcí alkoholů s pumpami....
|
|
|
Impact of protein transmembrane domains on membrane organisation
Šljivnjak, Erna ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Plazmatická membrána není statická, ale dynamická struktura, stále měnící svoji organizaci a lokální vlastnosti. Interakce mezi stavebními prvky plazmatické membrány a vnějšími faktory jsou zodpovědné za její dynamičnost. Pracuji s literaturou, která popisuje interakce mezi transmembránovými proteiny a lipidovými membránami a jejich důsledky. V práci diskutujii vliv délky a sekvencí transmembránových domén proteinů na navýšení, respektive snížení, tloušťky plazmatické membrány, nebo třídění a shlukování proteinů. Dále je naznačena role proteinů v různých modelech organizace plazmatické membrány. Na závěr poukazuji na nedávno objevený vliv hrubého povrchu TMD na lokální mobilitu a organizaci lipidů. Všechna shrnutá data jsou důkazem významu detailního porozumění TMD, jejich vlastností a vztahu k okolním lipidům membrán. Klíčová slova: membrána, protein, transmembránová doména, hydrofobní neshoda, třídění proteinů, modely organizace plazmatické membrány
|
|
|
Localisation of CD4 coreceptor and its variants in human T cells
Glatzová, Daniela ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
CD4 je koreceptorem T receptoru nacházejícího se na povrchu T lymfocytů. Jedná se o glykoprotein z rodiny transmembránových proteinů. Jeho přítomnost je nezbytná jak pro vývoj T lymfocytů, tak i pro jejich správnou funkci. Předpokládá se, že CD4 stabilizuje interakci T receptoru s jeho ligandem, MHC-peptidovým komplexem, a tím přispívá k imunitní odpovědi založené na T buňkách. Vnitrobuněčná část CD4 obsahuje řadu strukturních motivů, které většinou neovlivňují umístění proteinu v plasmatické membráně, ale mohou významně ovlivnit jeho umístění v rámci domén, které se v plazmatické membráně T lymfocytů tvoří. Ukázalo se, že se CD4 přechodně hromadí v místech interakce T buňky a antigen-prezentující buňky, nazvaných imunologická synapse. Krátce po nahromadění CD4 koreceptoru v imunologické synapsi je buď vyloučen z místa, kde se imunologická synapse vytvořila, nebo úplně odstraněn z plasmatické membrány. Tento jev je v nesouladu s chováním T receptoru, který se po vzniku imunologické synapse hromadí v její centrální části. Z tohoto důvodu zůstává nejasné, jakým způsobem CD4 koreceptor a T receptor spolupracují při vazbě MHC-peptidového komplexu během zahájení T buněčné signalizace. Naším cílem je studium umístění CD4 koreceptoru na plasmatické membráně s použitím pokročilých mikroskopických metod,...
|
|
|
Příprava rekombinatních extracelulárních domén leukocytárních receptorů AICL a NKR-P1CBALB
Čonka, Martin ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent)
v českém jazyce NK buňky jsou řazeny mezi populaci lymfocytů, která je schopna cytotoxicky usmrtit některé nádorové či viry infikované buňky. Předmětem této diplomové práce je myší NK buněčný receptor mNKR-P1CBALB a lidský leukocytární receptor hAICL. mNKR-P1CBALB je řazen mezi aktivační receptory a je schopen aktivovat cytotoxické funkce NK buněk vůči cílovým buňkám. Receptor hAICL je ligandem lidského aktivačního NK buněčného receptoru NKp80. Interakce mezi těmito proteiny též vede k aktivaci efektorových funkcí NK buněk. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní extracelulární části receptorů mNKR-P1CBALB a hAICL, optimalizovat jejich in vitro renaturaci a charakterizovat tyto proteiny pomocí hmotnostní spektrometrie. Takto získané proteinové preparáty poslouží k dalšímu studiu struktury extracelulárních částí těchto leukocytárních receptorů.
|
host ::
RSS.