|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z vybraných tepelně zpracovaných výrobků rostlinného původu
Hronová, Aneta ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na testování mikroizolace DNA za pomocí magnetických částic z tepelně zpracovaných potravinových výrobků v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro analýzu byly vybrány rybízové džemy. Ty byly homogenizovány s použitím plastového kopistu a stomacheru v lyzačním roztoku s cetyltrimetylammonium bromidem (CTAB). Při přípravě homogenátů byl testován vliv chloroform-oktanolu a isopropanolu. Homogenáty byly použity pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Po odstředění komplexů CTAB s proteiny, polyfenoly a polysacharidy byla hrubá frakce DNA purifikována vazbou na magnetické částice. Byly testovány dva druhy magnetických částic: mikročástice poly(hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) - P(HEMA-co-GMA) a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) - PLL. Izolovaná DNA byla podrobena spektrofotometrické analýze, kde byla zjišťována její koncentrace a kontaminace polyfenoly a proteiny. Poté byla testována amplifikovatelnost DNA v PCR. Pro amplifikaci byly použity primery specifické pro rostlinnou ribosomální DNA. Produkty PCR s očekávanou délkou 700 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, že z džemů lze pomocí testovaných magnetických nosičů izolovat DNA v kvalitě vhodné pro PCR.
|
|
|
Potravinové výrobky s probiotiky
Zemanová, Tereza ; Valicová, Markéta (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Fermentované mléčné výrobky s obsahem probiotických mikroorganismů, které se vyznačují příznivými účinky na střevní mikroflóru, jsou v dnešní době konzumovány ve velkém množství. Nabídka výrobků, do kterých jsou mikroorganismy přidávány, se v posledních letech velmi rozšířila. V současné době jsou na trhu dostupné nejen mléčné, ale například i masné či zeleninové výrobky tohoto typu. Cílem práce je seznámení se s probiotickými mikroorganismy, popis jejich využití v potravinářství a toho, zda mají pro nás ,,Homo sapiens sapiens‘‘ příznivé či nepříznivé účinky a dokázat přítomnost těchto bakterií ve vybraných fermentovaných mléčných výrobcích.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Vliv polysacharidové kontaminace na molekulárně-biologickou analýzu
Žylková, Kateřina ; Strečanská, Paulína (oponent) ; Fialová, Lenka (vedoucí práce)
Přítomnost polysacharidů při izolaci DNA a její následné analýze přináší často nežádoucí účinky. Polysacharidy spolu s dalšími metabolity (fenolické látky, proteiny) mohou působit jako inhibitory PCR. V této práci byl zkoumán právě vliv polysacharidové kontaminace na analyzovanou DNA. V experimentální části byly ze dvou druhů exotického ovoce (mango, banán) izolovány vzorky DNA, ze kterých byla následně stanovena koncentrace polysacharidů. Analýza prokázala, že přidáním CaCl2, byl obsah polysacharidů ve vzorcích výrazně nižší. Po ověření amplifikovatelnosti vzorků DNA s přidaným CaCl2 bylo zjištěno, že CaCl2 sám PCR inhiboval, a proto ho bylo nutné ze vzorků odstranit. Po přečištění byla znovu ověřena amplifikovatelnost DNA a bylo zjištěno, že právě DNA s CaCl2 po přečištění dosahuje nejlepších výsledků. Tyto výsledky byly dále ověřeny agarózovou gelovou elektroforézou, která potvrdila, že snížení obsahu polysacharidů ve vzorcích napomáhá amplifikaci DNA. Rovněž bylo vypozorováno, že záleží na typu polysacharidů vyskytujících se v zdrojovém rostlinném materiálu. DNA banánu vykazovala lepší amplifikační výsledky než DNA manga. Je to způsobeno jiným chemickým složením těchto druhů ovoce. Banán na rozdíl od manga, neobsahuje polysacharidy, které by výrazně kontaminovaly izolovanou DNA.
|
|
|
Využití pokročilých molekulárně biologických technik pro detailní charakterizaci probiotických bakterií z doplňku stravy
Folwarczná, Tereza ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Smetana, Jan (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce byl průkaz probiotických bakterií z probiotického doplňku stravy ve formě sirupu. Z komplexní matrice výrobku byla izolována DNA v dostatečné čistotě a kvalitě vhodné pro metodu PCR v reálném čase a následně PCR-HRM. K amplifikaci pomocí PCR v reálném čase a PCR-HRM byly použity specifické primery pro rody Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus a na úrovni druhu pro druhy Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis a Streptococcus thermophilus. Po optimalizaci podmínek pro specifické primery byly ve výrobku prokázány všechny deklarované bakterie.
|
|
| |
|
|
Studium využití uracil-DNA glykosylasy s cílem zamezit kontaminací testovaných vzorků produkty předchozích DNA amplifikačních reakcí
Zrnová, Adéla ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Amplifikace DNA je velmi důležitý nástroj diagnostiky infekčních nemocí. Nejběžněji používanou metodou v laboratořích je polymerázová řetězová reakce, která však nesplňuje potřebu rychlé a vybavením nenáročné metody. Bylo tedy nutné vyvinout metodu, která bude citlivá, rychlá, specifická a dostupná i například pro rozvojové země s omezeným přístupem k přístrojovému vybavení. Zdá se, že touto metodou by mohla být LAMP. Metoda LAMP se bohužel setkává se značnou falešnou pozitivitou, které je třeba zabránit, aby ji bylo možné využít v praxi. Předmětem předkládané bakalářské práce je zavedení unikátní LAMP metody detekce přítomnosti DNA Streptococcus pneumoniae a dále studium využití uracil-DNA glykosylasy k zamezení kontaminace vzorků pomocí DNA vzniklé v předchozích amplifikačních reakcích. LAMP metoda detekce DNA Streptococcus pneumoniae byla úspěšně zavedena, poté byla metoda optimalizována i v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu. Po zjištění vhodné koncentrace deoxyuridintrifosfátu pro LAMP amplifikaci, byly takto vzniklé produkty amplifikace DNA Streptococcus pneumoniae ošetřeny pomocí uracil-DNA glykosylasy. Bylo prokázáno, že tento postup má potenciál zamezit falešné pozitivitě dalších amplifikačních reakcí pro detekci DNA Streptococcus pneumoniae v laboratoři. Klíčová slova: polymerázová...
|
|
|
Porovnání různých molekulárně-biologických přístupů pro detekci přítomnosti DNA patogenní bakterie Haemophilus influenzae
Smrčka, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Haemophilus influenzae patří mezi hlavní původce meningitidy a zápalu plic u dětí. Zavedení rychlé, levné a přístrojově nenáročné metody detekce tohoto patogenu by zásadní měrou přispělo k včasné a cílené léčbě pacientů. Rozvoj amplifikačních metod v posledních dekádách umožňuje, krom běžně používané metody PCR, aplikaci alternativních přístupů, mezi něž patří i metoda LAMP. Předmětem zájmu této bakalářské práce proto bylo studium alternativní metody LAMP jakožto nástroje pro detekci Haemophilus influenzae. LAMP metoda byla pro Haemophilus influenzae úspěšně zavedena, nicméně se potýkala s falešnou pozitivitou negativní kontroly v případě delších inkubačních časů. Byla proto navržena optimalizovaná metoda LAMP v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu a uracil-DNA glykosylasy. Jejím cílem bylo za pomocí inkorporace uracilů do amplifikovaných úseků DNA a následného odštěpení uracilů působením uracil-DNA glykosylasy pozměnit strukturu amplifikačních produktů, zabránit tak jejich replikaci při případné kontaminaci reakčních směsí při dalších stanoveních a tím snížit riziko falešné pozitivity negativních kontrol na minimum. Byla optimalizována koncentrace deoxyuridintrifosfátu v reakční směsi pro výše uvedené účely. Zásadním přispěním předkládané bakalářské práce k optimalizaci LAMP metody pro detekci...
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Distribution of Heterobasidion and Armillaria root rots in Vallombrosa fir forest, Italy
Dálya, László Benedek
Diplomová práce je zaměřena na studium aktuální fytopatologické charakteristiku porostů ve Vallombrosa Forest (Toskánsko, Itálie). Klíčovým faktorem, který ovlivňuje vitalitu jedle bělokoré v regionu jsou chronické infekce kořenovými hnilobami způsobené kořenovníkem Heterobasidion spp. a václavkami Armillaria spp. Podrobné znalosti o jejich rozšíření by mohly napomoci k implementaci ochranných opatření proti těmto patogenům. Zkoumané vzorky byly odebrány ze stromů z 52 míst. Byla provedena identifikace hub z půdy metodami založenými na DNA (TSCP, nested PCR, analýza RFLP). V širokém rozsahu ekologických podmínek lokality byla zjištěna vysoká frekvence obou původců kořenových hnilob. Analýza dat ukazuje na silný potenciál obou patogenů dále se na lokalitě šířit, a to především v důsledku stresové zátěže hostitelů nedostatkem vody.
|
host ::
RSS.