|
|
Analýza změn genomu C. necator po evoluční adaptaci
Kroupa, Štěpán ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá analýzou mutačních změn bakteriálních populací Cupriavidus necator H16 po evoluci za různých stresových podmínek. Tato analýza byla provedena zpracováním dat z metody sekvenování genomu „Next Generation Sequencing“, která byla provedena externí společností DNALink. Na základě bioinformatického postupu byl sestaven seznam mutačních změn pro každou adaptovanou populaci. Dále byly stanovené mutační změny asociovány s konkrétními oblastmi referenčního genomu Cupriavidus necator H16 z NCBI a analyzovány dle dostupných informací. Na závěr byl diskutován případný vliv stanovených mutací na produkci zásobních polymerů polyhydroxyalkanoátů.
|
|
|
Stability of PHA-based particles and fibres in different environments
Tarageľ, Matej ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
The aim of this diploma thesis is the preparation of liposome nanoparticles enriched with PHA and PHA nanofibers. The nanostructures served to encapsulate extracts of lipophilic and hydrophilic nature. The characterization of the properties of nanostructures such as polydispersity, size, colloidal stability, long-term stability after exposure to various environments such as seawater, water from the Brno dam and tap water, and finally the cytotoxicity of fibers with extracts was addressed. The theoretical part is focused on different types of water, human skin, coffee and subsequently carotenoids. It continues by describing of possibilities of extraction and preparation of lipophilic and hydrophilic extracts and possibilities of their determination is discussed. Finally, it describes the possibilities of preparation and characterization of PHA based nanomaterials. The practical part deals with the preparation of liposome particles and fibers enriched with PHA with encapsulated extracts, their characterization, and their subsequent exposure to various environments. Monitoring of their long-term stability was carried out, but the release of the encapsulated extracts into the environment to which the nanoparticles and nanofibers were exposed was also measured. Finally, the interaction of nanofibers with live HaCaT cells was monitored, and cytotoxicity assays determined the viability of the cells after interaction with the nanofibers.
|
|
|
Analytical methods for qualitative and quantitative determination of PHA in cyanobacteria
Černayová, Diana ; Samek, Ota (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
The diploma thesis is confused to verify the applicability of selected physicochemical and spectroscopic methods for characterization of cyanobacteria, with special emphasis on possibilities of qualitative and quantitative analysis of polyhydroxyalkanoates (specifically polyhydroxybutyrate (PHB)) accumulated in cyanobacterial cells. The sample basis of the work was formed by cultures of cyanobacterial strains of Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192. The cultures were were cultivated in several ways to cover the widest possible range of physiological conditions and PHB contents, in particular using an autotrophic way of cultivation on shakers and multicultural culture method in a basic culture medium,and in media enriched with 2% salt (NaCl ) as well as mixotrophic culture media with different types of the carbon substrate. After few weeks of cultivation, cyanobacterial cultures were obtained and complexly analyzed by following techniques- cell suspensions were analyzed by flow cytometry and UV-VIS spectrometry (transmission and diffusion transmission mode), dry cell biomass was characterised by gas chromatography to obtain a exact amount of PHB, and then FT-IR spectrometry and thermogravimetric analysis. The work aimed to assess whether any of these methods can be a quick and affordable alternative to the determination of PHB content to the most commonly used method of gas chromatography, but also to assess what additional information about the physiological state of cyanobacterial cells can provide test methods. The highest correlation on PHB content was determined for the parameters determined by infrared spectroscopy, in which specific peaks from the characteristic wavelengths for polyhydroxybutyrate were important. Weak correlations on PHB content were achieved in thermogravimetric analysis and cytometry, using the hydrophobic fluorescent probe BODIPY 439/503, which bound to lipophilic parts of cells. In addition to the determination of PHB, it was possible to determine pigments present in cyanobacteria (such as chlorophyll, phycocyanin and carotenoids) by flow cytometry and UV-VIS diffusion transmission spectrometry. In the end, results from all used techniques were compared by PCA analysis to determine the similarity of all analyzed samples.
|
|
|
production of PHA by selected extremophilic bacteria
Šarköziová, Patrícia ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor´s thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by thermophilic bacterial strains of Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii. We were finding out the best conditions for production of PHA granules inside the cells. In the beginning of the experiment we employed PCR to detect the phaC gene, encoding for PHA synthase, which is requisite for production of PHA. We also analyse the best source of carbon, optimal temperature for production of polyhydroxyalkanoates and influence of chosen precursors to grow of biomass and production of copolymers. The last part of this experimental thesis deals with research utilization of selected model hydrolysates. Glucose was the best source of carbon for both bacteria Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii and optimal temperature for grow and production of P(3HB) was 45°C. The applied precursors inhibited cell grow, but both bacterial strains Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii could produce copolymer P(3HB-co-3HV) after additiong of precursors sodium propionate and valeric acid. For both bacterial strains was the most useful model hydrolysates, which contains the biggest part of glucose. Morever, bacterial cells containing PHA granules were observed by fluorescence and transmission electron microscopy.
|
|
|
Utilization of physicochemical and spectroscopic techniques in study of stress-response of cyanobacteria
Skoryk, Maksym ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor's thesis focuses on observation of cyanobacteria exposed to osmotic-up and down stresses. Based on literature review appropriate methods have been proposed to study two model organisms - Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis sp. salina Wislouch CCALA 192. Four methods have been utilized to characterize osmotically stressed cyanobacteria. Flow cytometry has been utilized to assess viability of bacteria. SYTOX Blue fluorescent stain provided reliable information on bacteria stress resistance, whilst when stained with propidium iodide obscured results were obtained. Optical properties of cyanobacteria have been characterized with UV-VIS absorbance and turbidity measurements. Bacteria have undergone thermogravimetric analysis upon stress exposure to estimate cell volume dependence on extent of salt stress. This analysis suggested that PHB-positive Synechocystis sp. PCC 6803 tend to be more endurable to osmotic up-stress than PHB-negative. Gas chromatography showed PHB-positive cells to contain 1-2 % of PHB per dry cell mass.
|
|
|
Isolace, charakterizace a aplikace biomedicínsky významného polymeru P(3HB-co-4HB)
Krupičková, Kristýna ; Přikryl, Radek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá izolací a charakterizací kopolymeru P(3HB-co-4HB). Teoretická část byla zpracována jako literární rešerše, která popisuje obecně polyhydroxyalkanoáty, jejich strukturu, syntézu, degradaci a izolaci. Dále jsou v práci uvedeny kopolymery obsahující 4HB jednotky a nechybí zde ani zmínka o biosyntéze a biodegradaci kopolymeru P(3HB-co-4HB). Cílem této diplomové práce bylo zjistit, které rozpouštědlo je pro extrakci kopolymeru nejlepší a následně takto vyextrahovanou fólii kopolymeru P(3HB-co-4HB) charakterizovat. Vyizolovaný kopolymer byl charakterizován pomocí plynové chromatografie, SEC-MALS termické analýzy a SEM. V druhé části práce bylo studováno uvolňování modelové biologicky aktivní látky z PHA fólie v přítomnosti různých hydrolytických enzymů. Pro simulaci bylo vybráno barvivo Rhodamin 6G, kterým byly obarveny fólie kopolymeru a fólie P(3HB). Fólie připravená z P(3HB-co-4HB) kopolymeru uvolňovala modelovou látku vyšší rychlostí než fólie z homopolymeru P(3HB), kopolymer byl také náchylnější k degradaci použitými enzymy.
|
|
|
Biodegradace bioplastů v prostředí kompostu
Vodička, Juraj ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předmětem této diplomové práce je studium biodegradace polyhydroxybutyrátu (PHB) a polyesteru kyseliny mléčné (PLA). Teoretická část práce pojednává o původu studovaných biopolyesterů, jejich vlastnostech a využití, a také enzymologii jejich biodegradace. Experimentální část práce je zaměřena na biodegradaci těchto polymerů v submerzním mediu využitím termofilních kmenů a na kompostování těchto bioplastů. Ze šesti použitých kmenů termofilních bakterií projevil významnou PHB-biodegradační aktivitu pouze jeden – kmen Schlegelella thermodepolymerans. Rezistenci vůči submerzní degradaci vykazovala amorfní i semi-krystalická forma PLA. V prostředí kompostu docházelo především k rozpadu obou forem PLA, proto byl dedukován primárně abiotický mechanizmus degradace. Během 4 týdnů kompostování došlo ke ztrátě hmotnosti amorfního PLA o 99 % a semi-krystalického PLA o 63 hmot. %. Hmotnostní úbytek PHB po stejné době kompostování dosahoval 36 %, navíc bylo pozorováno snížení molekulové hmotnosti na zhruba polovinu hodnoty využitím SEC. Pro tento polymer byl potvrzen mechanizmus biodegradace formou povrchové enzymatické eroze využitím SEM. Monitoring aktivity esteráz, lipáz a proteáz během celého experimentu neprokázal statisticky významné ovlivnění kompostu přítomností biopolymerů.
|
|
|
Izolace ligninu z hroznových semen a jeho aplikace jako plniva pro polyhydroxyalkanoáty (PHA)
Vostrejš, Pavel ; Vítová, Eva (oponent) ; Kovalčík, Adriána (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá přípravou polymerních filmů z polyhydroxyalkanoátů (PHA) a jejich modifikací přídavkem ligninu jako aktivního aditiva. Motivací bylo vytvořit materiál s potenciálním využitím jako aktivní obal potravin. Polymerní filmy byly připraveny z čistého krystalického poly(3-hydroxybutyrátu) (P3HB) nebo ze směsi krystalického P3HB a amorfního polyhydroxyalkanoátu (P3HB/PHA). Aplikovaný lignin byl izolován z hroznových semínek, které jsou odpadním produktem ve vinařském průmyslu. Izolovaný lignin byl dále upraven acetylací za účelem zlepšení jeho rozpustnosti v chloroformu. Lignin byl charakterizován stanovením prvkového složení, minerálních látek a infračervenou spektroskopií (FTIR). Dále byla metodou FTIR potvrzena úspěšná acetylace ligninu. Lignin byl přidán jako aktivní aditivum v koncentraci, 1, 5 a 10 % do P3HB a P3HB/PHA filmů připravených rozpouštěním v chloroformu. Byly testovány termální a mechanické vlastnosti polymerních filmů s ligninem a bez ligninu. U P3HB filmů nebylo zaznamenáno zlepšení mechanických vlastností přidáním ligninu. Avšak u směsného polymeru P3HB/PHA došlo u filmů s ligninem k výraznému zlepšení Youngova modulu a pevnosti v tahu. Naopak aplikace acetylovaného ligninu se pro zlepšení mechanických vlastností neosvědčila. Termální vlastnosti byly hodnoceny pomocí metod diferenční skenovací kalorimetrie a termogravimetrie. Bylo zjištěno, že lignin zvýšil tepelnou stabilitu PHA filmů a byl potvrzen jeho účinek jako nukleačního činidla. Funkci aktivního obalu zajišťoval lignin svými antioxidačními vlastnostmi, které byly prokázány ABTS testem. Dále byly ověřeny bariérové vlastnosti. Připravený materiál vykazoval v porovnání s běžně používanými polymery velmi dobré hodnoty.
|
|
|
Studium metabolismu bakteriálních buněk a vlivu stresu na biosyntézu PHA
Kučera, Dan ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Ondrejovič,, Miroslav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce se zabývá studiem biosyntézy polyhydroxyalkanoátů, jakožto mikrobiálního produktu s potenciálem nahradit současné konvenční plasty vyráběné z ropy. Dizertační práce je vypracovaná ve formě diskutovaného souboru již uveřejněných publikací, které jsou pak součástí práce ve formě příloh. Práce navazuje na poměrně rozsáhlé znalosti v oblasti produkce polyhydroxyalkanoátů a přináší nové skutečnosti a možné strategie. V rámci práce byly testovány rozličné možnosti analýzy polyhydroxyalkanoátů pomocí moderních metod, které přináší především rychlost, která může být klíčová při „real-time“ evaluaci produkčního biotechnologického procesu. Ramanova spektroskopie se ukázala jako velice perspektivní technika pro rychlou kvantifikaci PHA. Dále se práce zabývá valorizací odpadů potravinářského a zemědělského původu. Důraz je kladen především na metody detoxifikace hydrolyzátů lignocelulózy. V tomto kontextu byla poprvé využita adsorpce inhibitorů na lignin jako alternativa k dalším detoxifikačním technikám. Vybrané produkční kmeny Burkholederia cepacia a B. sacchari byly díky detoxifikaci schopné utilizovat hydrolyzát měkkého dřeva pro produkci PHA. V další části práce byla testována také možnost využítí kuřecího peří jako komplexního zdroje dusíku. V rámci práce bylo také využito evoluční inženýrství jako možná strategie pro eliminaci inhibičního účinku kyseliny levulové – mikrobiálního inhibitoru, který vzniká při hydrolýze lignocelulózových materiálů. Adaptačními experimenty byly z původního divokého kmene C. necator vyvinuty kmeny projevující se vyšší odolností ke kyselině levulové a schopné akumulovat kopolymer s vyšším zastoupením 3HV. Dalším slibným přístupem testovaným v rámci práce bylo využití extrémofilního mikrobiálního kmene, což vede ke snížení nákladů na biotechnologickou produkci. Vybrané druhy rodu Halomonas prokázaly vysoký potenciál jako halofilní producenti PHA. Závěrečná část práce se věnovala výběru produkčního kmene s ohledem na vlastnosti výsledného PHA. Kmen Cupriavidus malaysiensis byl vybrán za účelem produkce terpolymeru P(3HB-co-3HV-co-4HB) u kterého byly odhaleny značné rozdíly v materiálových vlastnostech oproti P3HB.
|
|
|
Evolutionary engineering of PHA producing bacterium Halomonas halophila
Ikrényiová, Terézia ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with evolutionary engineering of PHA producing bacteria, the principle of PHA production and solution of this production’s disadvantages, but also applications of these biopolymers in the theoretical part. The production of polyhydroxyalkanoates by bacteria Halomonas halophila, which is focused on gaining the maximus amount of 3-hydroxyvalerate in formed copolymer, is described in the experimental part. The precursor valeric acid was added to bacteria due to gain the amount of 3HV. It was found that the concentrations over 3 g/l aren´t usable for production sufficient concentration of PHA. The very low concentrations of valeric acid led to low amount of 3HV in PHA. The available concentration of this precursor for production sufficient concentration of PHA by bacterial cell is 3 g/l. Moreover, it was found that the valeric acid should be added after 24 hours of cultivation in mineral production medium. The thesis is also concentred on comparison the original bacterial strains of Halomonas halophila to strains, which were adapted on valeric acid as stress factor for bacteria. The assumption, that the adapted strains can better utilize valeric acid and the incorporation to copolymer of it is higher like the original strains, was affirmed.
|
host ::
RSS.