|
|
Simulace interakce steroidních allosterických modulátorů NMDA receptorů s membránou
Riedlová, Kamila ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Novák, Josef (oponent)
Metoda molekulové dynamiky (MD) umožňuje v reálném čase sledovat vývoj systému složeného z atomů a molekul. Takovým systémem může být např. lipidová dvojvrstva a biomolekula. MD simulace se nejčastěji uplatňuje v návrhu léčiv, kdy laboratorní experimenty s reálným objektem mohou být finančně a časově náročné nebo neproveditelné. Cílem této práce bylo objasnit využití a užitečnost metody MD aplikované na studium lipidových dvojvrstev a ukázat praktické využití této techniky, kterým je studium chování neurosteroidů v lipidových dvojvrstvách. Vhodně navržené a uměle syntetizované neurosteroidy by se mohly uplatnit v léčbě vážných neurologických onemocnění. Součástí této práce jsou i experimentální data získaná MD simulacemi pro vybrané neurosteroidy - pregnanolon glutamát a pregnanolon sulfát. Pomocí MD simulace bylo sledováno chování těchto molekul v modelových membránách a analyzováno. Klíčová slova: molekulově dynamická simulace, modelová membrána, lipidová dvojvrstva, NMDA receptor, neurosteroidy, pregnanolon glutamát, pregnanolon sulfát
|
|
|
Intracelulární život patogenní bakterie Francisella tularensis v hostiteli.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Francisella tularensis je fakultativně intracelulární patogenní bakterie, která způsobuje u hostitele onemocnění nazvané tularémie. Pro vstup do hostitelské buňky využívá Francisella hostitelské buněčné mechanismy, kterými je inkorporována do buněčného fagozomu. Z fagozomu následně uniká do cytosolu, kde probíhá bakteriální pomnožení. Některé pomnožené bakterie jsou odstraňovány autofagií, z jiných se uvolňuje dsDNA, která je rozeznána cytosolickými senzory, které vytvoří inflamazomový komplex. Inflamazom spouští dráhu vedoucí k smrti napadené buňky. Francisella již od průniku do buňky ovlivňuje buněčnou signalizaci ve svůj prospěch tak, aby si zajistila dostatečný čas a dostatek potřebných živin pro své pomnožení. Francisella nepůsobí jen v napadené buňce, kde omezuje své rozeznání a odstranění z cytosolu, ale také indukuje sekreci faktorů z buňky, které utlumí aktivaci adaptivní imunity hostitele. Klíčová slova: Francisella, tularémie, fagozom, inflamazom, autofagie, adaptivní imunita
|
|
|
Vývoj a validace metod pro detekci GMO
Hodek, Jan ; Ovesná, Jaroslava (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Pazlarová, Jarmila (oponent)
V předkládané práci je řešena problematika stanovení geneticky modifikovaných organismů (GMO) v rostlinách a odvozených produktech. Platná legislativa v Evropské unii nařizuje sledování GMO a upravuje pravidla pro jejich značení a dohledatelnost. Cílem práce bylo přispět k řešení vybrané problematiky kritických bodů stanovení GMO. Prvním bodem byla extrakce DNA. Problematika byla řešena pro případ extrakce DNA z plodů papáji a z kandované papáji. Pro obě potraviny byla vhodnost vybrané metody extrakce ověřena a potvrzena amplifikací specifického úseku extrahované DNA metodou PCR. Dalším bodem byla real-time PCR, kdy byla řešena problematika inhibitorů reakce. Byla ukázána inhibice real-time PCR vlivem EDTA a vlivem zbytkového množství iontů těžkých kovů, obsažených v laboratorním plastu. V obou případech vedla inhibice k ovlivnění efektivity reakce. Další kritickou částí stanovení GMO je používání screeningových elementů. Práce byla zaměřena na falešnou pozitivitu výsledků. Dalším cílem práce byl vývoj nových metod pro stanovení GMO. Byla představena metoda real-time PCR pro kvantifikaci taxon-specifického genu hrachu setého. Metoda byla ověřena na 13 kultivarech hrachu setého a vybraných příbuzných rostlinách čeledi bobovitých. Použití metody vysoce účinné kapalinové chromatografie s hmotnostním...
|
|
|
Ekologie hub, asociovaných s tlejícím dřevem v ekosystémech přirozených lesů
Zrůstová, Petra ; Baldrian, Petr (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Tlející dřevo hraje důležitou roli v lesním ekosystému z hlediska koloběhu uhlíku a živin, regenerace lesa a uchování biodiverzity. Poskytuje prostorové niky a potravní zdroje značnému množství hub, bakterií, bezobratlých a dalším organismům. Ligninocelulóza dřeva představuje velmi odolný a obtížně rozložitelný materiál, jehož dekompozice se účastní hlavně vláknité houby. Složení houbového společenstva se mění v průběhu dekompozice, ale vztah mezi kvalitativními vlastnostmi substrátu a společenstvem dekompozitorů není zdaleka objasněn. Tato práce je zaměřena na komplexní popis houbového společenstva tlejícího dřeva vzhledem k druhu stromu, stádiu rozkladu, objemu a fyzikálně-chemickým vlastnostem dřeva jako je pH, obsah uhlíku a dusíku. Pro charakterizaci houbového společenstva byly použity sekvenační metody nové generace - 454- pyrosekvenování a sekvenování na platformě Illumina MiSeq. Druh stromu, objem dřeva (větve, kmeny) a délka tlení byly hlavními proměnnými vysvětlujícími rozdíly ve složení společenstev. Počáteční kolonizace houbami byla rychlejší u větví nežli u kmenů - svědčily o tom vyšší hodnoty enzymových aktivit a vyšší obsah houbové biomasy. Se změnou společenstva hub v průběhu dekompozice se měnily i fyzikálně-chemické vlastnosti dřeva a hodnoty enzymových aktivit. Se stoupajícím...
|
|
|
Morfogeneze bakteriálních kolonií
Čepl, Jaroslav ; Markoš, Anton (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Nemec, Alexandr (oponent)
Tato disertace svým tématem navazuje na předchozí práce naší skupiny, zejména Rieger et al. 2008 a Čepl et al. 2010. Popisovali a zkoumali jsme pravidelnosti morfogeneze kolonií S. marcescens morfotypu F (od "fontána", kterou nám kolonie svým tvarem připomínaly). Kolonii tvoří červený vystouplý střed, nízké nepigmentované mezikruží a znovu vystouplý červený lem, jehož vytvořením kolonie ukončuje svůj růst. Jasně strukturovaný profil kolonie tohoto morfotypu, společně se změnami pigmentace struktur v průběhu vývoje, bez nutnosti umělé vizualizace, poskytuje pro pozorování morfogeneze značnou výhodu. Naším cílem se postupně stalo (i) najít další faktory, které ovlivňují tuto morfogenezi a pokusit se blíže popsat; (ii) druhým cílem byla charakterizace interakcí kolonií S. marcescens s jinými bakteriálními kmeny (S. rubidaea a E. coli) a konečně (iii) studovat fenomén indukované resistence k antibiotikům popsaný v (Heal and Parsons 2002; Lu 2004; Bernier et al. 2011) u našich modelových organismů. (i) Vzájemné vztahy kolonií na misce ukazují, že morfogeneze kolonie je ovlivněna autokinními signály, které difundují do media a do atmosféry a ovlivňují vývoj i okolních kolonií. Během vývoje kolonie jsme také pozorovali změny pH media v jejím okolí -...
|
|
|
Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS)
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů - ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle.
|
|
|
Konformační změny proteinových membránových senzorů
Sklenářová, Petra ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Fraiberk, Martin (oponent)
Tato práce je zaměřena na stavbu a funkci prokaryotických signálních systémů. V bakteriích se nacházejí tři typy signálních systémů: jednokomponentové, dvoukomponentové a tříkomponentové systémy. Tyto tři systémy se od sebe liší zejména stavbou a počtem proteinů a domén, které jsou jejich součástí. Zabývala jsem se zejména dvoukomponentovými systémy u bakterií, i když byl jejich výskyt potvrzen i u nižších eukaryot. Prokaryotické dvoukomponentové systémy jsou hlavními prostředky, kterými bakterie rozpoznávají různé podněty z prostředí a reagují na ně. U bakterií jsou dosud popsány dva typy dvoukomponentových systémů. Prvním je základní systém a druhým systém složený. Oba typy dvoukomponentových systémů obsahují dva nepostradatelné proteiny: histidin kinázu a odpovídající regulátor. Liší se však doménovou stavbou proteinů a mechanizmem přenosu signálu. U základního systému přenos probíhá ve dvou krocích, u složeného celkem ve čtyřech krocích. Vždy je však princip stejný, jde o přenesení fosfátové skupiny z histidin kinázy na odpovídající regulátor, který je tímto signálem aktivován a může regulovat transkripci DNA.
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
|
Supported Phospholipid Bilayers and their Interactions with Proteins Studied by Ellipsometry, Atomic Force Microscopy and Confocal Fluorescence Microscopy
Macháň, Radek ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Fidler, Vlastimil (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Podporované lipidové dvojvrstvy sloužily jako umělý model biologických membrán při studiu membránové aktivity 5 vybraných antimikrobiálních peptidů. Hlavními experimentálními technikami byly elipsometrie, laserová řádkovací mikroskopie a fluorescenční korelační spektroskopie. Základní principy použitých experimentálních technik jsou vysvětleny v této práci s přihlédnutím k jejich stránkám podstatným pro charakterizaci lipidových dvojvrstev. Ve stručnosti je shrnut biologický význam antimikrobiálních peptidů a jejich působení na biologické membrány a jsou představeny základní vlastnosti vybraných peptidů. Následuje rozbor hlavních typů experimentálních studií a interpretace jejich výsledků. Morfologické změny lipidových dvojvrstev byly zkoumány elipsometrií a laserovou řádkovací mikroskopií. Nejzajímavější jevy byly pozorovány v případě melittinu, který vyvolal vznik dlouhých lipidových trubic vystupujících z dvojvrstvy. Laterální difúze lipidů měřená fluorescenční korelační spektroskopií vypovídá o uspořádání dvojvrstvy na vzdálenostech pod rozlišením optické mikroskopie.
|
|
|
Structural and functional characterization of yeast plasma membrane domains
Strádalová, Vendula ; Malínský, Jan (vedoucí práce) ; Palková, Zdena (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Plazmatická membrána (PM) všech buněk hostí celou řadu důležitých buněčných funkcí. Tyto funkce musí být pečlivě koordinovány, a jak současný výzkum ukazuje, plazmatická membrána je za tímto účelem uspořádána do specializovaných domén. Naše laboratoř se zabývá výzkumem způsobu organizace plazmatické membrány u kvasinky pivní, kde bylo za použití fluorescenční mikroskopie popsáno několik nepřekrývajících se domén. Jednou takovou doménou je MCC (Membrane Compartment occupied by transporter Can1), která je tvořena stabilními izolovanými oblastmi PM o velikosti asi 300 nm. MCC domény obsahují několik přenašečů a proteinů o neznámé funkci (proteiny příbuzné Sur7 a Nce102) a jejich formování je organizováno z cytosolu proteinovými komplexy zvanými eisosomy, jež jsou tvořeny především proteiny Pil1 a Lsp1. Tato práce navazuje na studie, které měly za cíl objasnit složení, strukturu a funkci MCC. V první části práce jsme se zaměřili na ultrastrukturální analýzu MCC, přičemž jsme nejdříve vyvinuli protokol pro transmisní elektronovou mikroskopii (TEM), který dobře zachovává strukturu PM. Zjistili jsme, že mrazová fixace pomocí vysokotlakého zamražení, kombinovaná s mrazovou substitucí a zalitím vzorku do pryskyřice za nízké teploty, vede k výrazně lepšímu zachování buněčné struktury a vyššímu signálu při...
|
host ::
RSS.