|
|
Využití pilin jako substrátu pro biotechnologickou produkci PHA
Ladický, Peter ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cieľom práce bolo štúdium vhodnosti hoblín a pilín ako substrátu pre mikrobiálnu produkciu PHA baktériami Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari. V experimentálnej časti práce bol skúmaný najvhodnejší spôsob hydrolýzy hoblín a pilín a vplyv koncentrácie furfuralu a polyfenolov na schopnosť akumulovať PHA. Burkholderia sacchari mala v porovnaní s Burkholderia cepacia vyššiu schopnosť akumulovať PHA. Pri kultivácii Burkholderia sacchari na médium obsahujúce detoxifikovaný hydrolyzát z pilín boli dosiahnuté hodnoty kedy PHB predstavoval 87–89 % celkovej koncentrácie biomasy. Piliny teda predstavujú sľubný substrát na mikrobiálnu produkciu PHA z hľadiska zníženia produkčných nákladov a vysokého obsahu PHB v biomase.
|
|
|
Analýza bakteriálních buněk pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie
Müllerová, Lucie ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi analýzy viability a obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakteriálních buněk, a to pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V části věnující se cytometrické analýze bakteriálních buněk byla otestována řada viabilních fluorescenčních sond, ale prakticky se osvědčily pouze dva systémy – propidium iodid a komerční BacLightTM kit, který vykazoval o něco vyšší přesnost stanovení viabilitně bakteriální kultury. Dále byla využita akridinová oranž k analýze fyziologického stavu mikrobiální kultury a dvě hydrofobní sondy, Nilská červeň a BODIPY 493/503, k analýze obsahu PHA v bakteriálních buňkách. Především sonda BODIPY 493/505 se zdá být velmi zajímavá, protože nevyžaduje permeabilizaci buněčných obalů a díky svým spektrálním vlastnostem je plně kompatibilní s propidium iodidem. Tato skutečnost otevírá možnost simultánní analýzy viability bakteriálních kultur a obsahu PHA. V části vyhodnocování mikroskopických výsledků bylo prezentováno několik fluoroforů. Bylo zjištěno, že koncentrace fluoroforů využívaná pro cytometrické analýzy je pro mikroskopii příliš vysoká. SYTO9 svítící převážně v zeleném kanále měla určitý fluorescenční signál i v červeném kanále. Vzorky obarvené BODIPY 493/503 vykazovaly vysoké intenzity fluorescence při koncentraci barviva 10 . Zároveň byly jak u obou kmenů naměřeny záporné amplitudy intenzity fluorescence, výraznější byla u C. necator H16. U tohoto kmene byl překvapivý objev vysoké koncentrace barviva především na povrchu granulí PHB, kde byla zároveň téměř nulová anisotropie barviva (volná otáčivost sondy).
|
|
|
Studium odolnosti bakterií vůči vybraným stresovým faktorům
Miléřová, Miluše ; Samek,, Ota (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce bylo studium vlivu akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA) na odolnost bakterií vůči vybraným stresovým faktorům. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se vybranými stresovými faktory, polyhydroxyalkanoáty a zapojením polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi. V experimentální části byla použita bakterie Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopný akumulace polyhydroxybutyrátu (PHB). Byla testována odolnost výše zmíněných bakteriálních kmenů vůči teplotnímu a osmotickému stresu. Na základě výsledků experimentu, kdy byly bakterie vystaveny 3 různým koncentracím NaCl (50, 100 a 200 g/l), bylo zjištěno, že PHB akumulující kmen vykazuje vyšší odolnost vůči hyperosmotickému stresu než jeho PHB neprodukující mutant. Ramanovou spektroskopií bylo dokázáno, že v hyperosmotickém prostředí došlo ke krystalizaci intracelulárních PHB granulí. Transmisní elektronovou mikroskopií bylo zjištěno, že kmen Cupriavidus necator H16/PHB-4 podléhá při hyperosmotickém stresu plazmolýze. U kmene Cupriavidus necator H16 dochází vlivem hyperosmotického stresu k agregaci intracelulárních PHB granulí, ale k plazmolýze nedochází nebo je výrazně méně intenzivní.
|
|
|
Metody identifikace PHA produkujících bakterií
Skřivanová, Veronika ; Turková, Kristýna (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá testováním, optimalizací a porovnáním metod vhodných pro identifikaci bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty. V rámci práce byly využity metody kultivační a mikroskopické, kde byly bakteriální buňky barveny lipofilními barvivy Nilská červeň a Sudánová čerň. Dále byla využita průtoková cytometrie a metody spektroskopické, a to Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací a také metody molekulárně biologické, kde byla analyzována přítomnost genu kódujícího PHA syntázu (phaC) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR test se skládá ze dvou reakcí, v první reakci je phaC gen amplifikován společně s 16S rRNA oblastí společnou pro všechny bakterie (multiplexní PCR). Druhá reakce je pak specifická pro PHA syntázu katalyzující biosyntézu mcl-PHA. Podle výsledků práce je při identifikaci PHA produkujících kmenů za účelem eliminace falešně pozitivních výsledků metod analyzujících genotyp a falešně negativních výsledků metod zkoumající fenotyp kombinovat oba přístupy. Jako velice perspektivní se jeví kombinace PCR pro stanovení přítomnosti phaC genu a následné analýzy přítomnosti PHA v bakteriálních buňkách. K tomuto účelu se nám nejlépe osvědčila Ramanova mikrospektroskopie, která je schopna zachytit i nízký obsah PHA v buňkách a zároveň nehrozí záměna PHA za jiné lipidické látky. Výsledky práce poskytují přehled testovaných metod, jejich výhody a nevýhody a také porovnání různých kritérií, dle kterých je možné vybrat metodu identifikace v závislosti na nastavených požadavcích.
|
|
|
Controlled Production and Degradation of Selected Biomaterials
Obruča, Stanislav ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Němec, Miroslav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Proposed dissertation thesis is aimed at the study of production and degradation of polymeric materials using microorganisms. The main attention is given to polyesters of bacterial origin - polyhydroxyalkanoates. These materials are accumulated by a wide variety of bacterial strains which use polyhydroxyalkanoates as a storage of carbon, energy and reducing power. Thanks to their mechanical properties, that are similar to those of traditional synthetic plastics such as polyethelene or polypropylene, and thanks to their biodegradability, polyhydroxyalkanoates are considered to be environmental-friendly alternative to traditional plastics of petrochemical origin. Thus, polyhydroxyalkanoates have many potential applications in industry, agriculture as well as in medicine. Important part of this thesis is focused on production of polyhydroxyalknotes from waste substrates coming from food industry. Among tested substrates was waste cheese whey or waste plant edible oils of different origin. Utilization of cheap waste substrates for polyhydroxyalkanoates production could facilitate economically feasible process of large scale production of polyhydroxyalkanoates. According to the results presented in this thesis, waste oils are very promising substrates for biotechnological production of polyhydroxyalkanoates. Next part of the thesis deals with involvement of polyhydroxyalkanoates into stress response of bacteria. It was observed, that exposition of bacterial culture to controlled dose of ethanol or hydrogen peroxide resulted in significantly enhanced yields (abut 30 %). After stress factors application, particular metabolic pathways involved in stress response were activated in order to endure stress conditions. Subsequently, NAD(P)H/NAD(P)+ ratio increased and, thus, Krebs cycle was partially inhibited whereas polyhydroxyalkanoates synthetic pathway was activated. Moreover, application of stress factors increased molecular weights of polymers. Therefore, strategy based on application of controlled dose of stress not only enhanced polymer yields, but, moreover, improved properties of materials. The last part of thesis describes the investigation of biodegradation of polyurethane elastomeric films modified by various biopolymers in presence of mixed thermophillic culture as a model of natural bacterial consortium. The presence of materials in cultivation medium resulted in delayed but intensive growth of bacterial culture. The unusually long lag-phase was caused by release of un-reacted polyether polyol and tin catalyst from materials. The main part of material degradation was caused by abiotic degradation of elastomeric films, nevertheless, also bacterial culture slightly contributed to material decomposition. The measure of biotic degradation strongly depended on type of used modification agent. The highest tendency to undergo biotic degradation was observed for elastomeric film modified by acetylated cellulose.
|
|
|
Utilization of lignocellulose materials for biotechnological production of polyhydroxyalkanoates
Kučera, Dan ; Márová, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This diploma thesis describes the possibilities of utilization of lignocellulosic material as a renewable resource to produce polyhydroxyalkanoates (PHA) by biotechnological methods. The theoretical part focuses on the characterization of plant waste biomass, its enzymatic saccharification and the possibilities of production and isolation of hydrolytic enzymes. Furthermore, the literature review deals with bacterial PHA production and the possibility to utilize lignocellulosic biomass for their production. In the experimental part, waste substrates hydrolyzed by chemical and enzymatic pathways were selected. Apple, wine and rapeseed pomace and spent coffee grounds were used as waste substrates. Burkholderia cepacia was employed for PHA production from obtained hydrolysates. Apple pomace appears to be the most promising substrate. It turned out that the selected bacterial strain is capable to utilize waste substrates even without previous treatment. The supernatant exhibited following activities after cultivation: protease, lipase (0.47 nmol/(mL•min)), cellulase for CMC (6.05 nmol/(mL•min)) and filter paper (4.63 nmol/(mL•min)) and xylanase (1.71 nmol/(mL•min)). These enzymes can represent an interesting byproduct PHA production from agricultural waste materials. The work assesses also the effect of time course of cultivation and method of hydrolysis on the resulting PHA production and enzymatic activity of industrially interesting enzymes.
|
|
|
Studium biodegradace polyhydroxyalkanoátů.
Wurstová, Agáta ; Přikryl, Radek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce je zaměřena na studium biodegradace polyhydroxyalkanoátů, konkrétně polymeru polyhydroxybutyrátu. První část práce se zabývá studiem biodegradace polyhydroxybutyrátu ve formě PHB prášku a PHB fólie pomocí vybraných druhů mikroorganismů z řad bakterií, kvasinek a plísní. Jako zástupce bakterií byl vybrán mikroorganismus Delftia acidovorans, z řad kvasinek Aureobasidium pullulans a ze zástupců plísní Aspergillus fumigatus. Aktivita extracelulární PHB depolymerázy byla analyzována turbidemitrickým měřením suspenze PHB granulí. Zároveň byla stanovena hodnota pH a teplotního optima jednotlivých PHB depolymeráz. Z výsledků vyplývá, že bakterie D. acidovorans dokáže částečně degradovat PHB, naopak kvasinka A. pullulans nedokáže PHB účinně degradovat. Nejvýraznější degradační schopnost vykazovala plíseň A. fumigatus, která PHB kompletně degradovala v rámci daného testu. Extracelulární enzymy exprimované těmito mikroorganismy při kultivaci na PHB jako jediném zdroji uhlíku byly analyzovány pomocí SDS-PAGE. Druhá část práce se zabývá biodegradací PHB ve formě PHB fólie, PHB tvrzené fólie a PHB Nanoul textilie v rámci standardního kompostovacího testu. Polosuchá kultivace podávala pozitivní výsledky, kdy v intervalu od 14. dnů do dvou měsíců byly zcela biodegradovány všechny formy použitých PHB. Co se týče polosuché kultivace, byla touto metodou ještě studována míra biodegradace polyuretanových elastomerů, kde část polyesterového polyolu byla nahrazena PHB (PU-PHB). Testovány byly vzorky obsahující komerční PHB od firmy Sigma a vzorky s PHB připravené na Fakultě chemické VUT v Brně. Jednotlivé vzorky se navíc lišily rozdílnou koncentrací dispergovaného PHB (1 %, 5 % a 10 %) v polyuretanu. Na konci kultivace, která trvala dva měsíce, byly zjišťovány mechanické změny materiálu v tahu, účinnost biodegradace vážkovou analýzou a změna povrchu materiálu analýzou mikroskopickou.
|
|
|
Charakterizace specifických proteinů z vybraných živočišných produktů.
Janhuba, Filip ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na specifické obranné proteiny z živočišných produktů, zejména na charakterizaci antimikrobiálního proteinu ovotransferinu (též „conalbuminu“) pocházejícího z vaječného bílku, který patří do skupiny transferinů a je do jisté míry analogem laktoferinu v mléce. Ovotransferin má velmi široké spektrum účinků, především antivirové, protirakovinové a imunomodulační. Jeho antimikrobiální aktivita vycházející z možnosti vázat železo je stále předmětem velkého zájmu. Pro srovnání charakteristik ovotransferinu byl použit další obranný vaječný protein, a to lysozym (N-acetylmuramidglykanhydrolasa). V teoretické části diplomové práce byl vypracován přehled o specifických antimikrobiálních proteinech ve vybraných živočišných produktech, kdy byl důraz kladen především na ovotransferin a lysozym. Experimentální část je zaměřena na optimalizaci metod stanovení antimikrobiální aktivity, koncentrace a čistoty těchto proteinů. Pro kvantitativní stanovení celkových proteinů byla využita optimalizovaná Hartree – Lowryho metoda a pro zjištění molekulové hmotnosti a čistoty byla provedena SDS-PAGE s vizualizací pomocí Coomassie Brilliant Blue G250 nebo pomocí barvení stříbrem. V rámci charakterizace byl reálný vzorek vaječného bílku souběžně srovnáván se vzorky antimikrobiálních tablet a s lyofilizovanými vzorky antimikrobiálních proteinů dodanými průmyslovým partnerem a bylo určeno jejich přesné proteinové složení a čistota. Studium antimikrobiální aktivity ovotransferinu bylo prováděno na kulturách bakterie Bacillus subtilis a pro srovnání i na gramnegativní bakterii E. coli. Ovotransferin vykázal antimikrobiální účinek i přes vysoký přídavek (100 mM) hydrogenuhličitanových iontů až při velmi vysokých koncentracích okolo 75 mg/ml (Bacillus subtilis) a 50 mg/ml (E. coli). Inhibiční efekt byl nejvíce patrný v tekutých médiích. U enzymu lysozymu bylo zjištěno, že vykazuje v případě kultury grampozitivních bakterií významnou inhibiční aktivitu již od 0,3 mg/ml. Naopak inhibiční účinek na E. coli pozorován nebyl. V další části byl ovotransferin izolován z vaječného bílku gelovou filtrací na koloně s náplní Sephadex G100. Jako mobilní fáze byly testovány 0,1 M fosfátový a 0,05 M Tris-HCl pufr. Čistota ovotransferinu byla srovnána s komerčním standardem pomocí SDS-PAGE. Na závěr byla testována možnost enkapsulace ovotransferinu a lysozymu do liposomových a chitosanových částic. Vlastnosti připravených částic byly studovány pomocí DLS a měření zeta potenciálu. Studována byla také stabilita částic v modelových fyziologických podmínkách.
|
|
|
Posouzení vybraných parametrů na biotechnologickou produkci polyhydroxyalkanoátů
Eremka, Libor ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem práce je studium mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA). V teoretické části je zpracován stručný přehled produkce PHA pomocí mikroorganismů a transgenních rostlin. Pro laboratorní práci byla využita průmyslově užívaná bakterie Cupriavidus necator H16. Různé odpadní oleje byly použity jako jediných zdroj uhlíku a energie. Pro zlepšení materiálových vlastností PHA byly použity prekurzory 1-propanol a propionát sodný, které byly inkorporovány do polymeru ve formě 3-hydroxyvalerátu (3HV). Hlavní část experimentální práce byla zaměřena na studium vlivu aerace (koncentrace rozpuštěného kyslíku v médiu) na tvorbu biomasy, na ovlivnění vybraných metabolických drah a na akumulaci PHA. Dle získaných experimentálních výsledků byla potvrzena závislost mezi aerací a monomerním složením PHA. Dále byl potvrzen fakt, že vyšší koncentrace kyslíku podporuje bakteriální růst a ovlivňuje intenzitu akumulace PHA v buňkách. NADPH má podstatný vliv na osud acetyl-CoA v metabolismu, vyšší vnitrobuněčná koncentrace NADPH inhibuje citrátový cyklus a zvyšuje akumulaci PHA v buňkách. Z toho důvodu byla vyhodnocena enzymová aktivita vybraných intracelulárních enzymů v závislosti na intenzitě aerace, včetně enzymů schopných generovat NADPH.
|
|
|
Biodegradabilita přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů
Pala, Martin ; Babák, Libor (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývala studiem biodegradability přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů. První část práce byla zaměřena na studium vlivu struktury PHA granulí na jejich biodegradabilitu pomocí vybraných enzymů a vliv fyziologických podmínek na stabilitu PHA. Celkově se zdá, že testovaný polymer, ať už v krystalické nebo amorfní formě je rezistentní vůči ataku použitých hydrolytických enzymů jako jsou lipáza nebo proteáza a je stabilní v simulovaných fyziologických prostředích. Díky tomu je možné uvažovat o využití PHA materiálů v biomedicínských aplikacích jako jsou například implantáty, které vyžadující spíše rezistentní materiály. Druhá část práce se zabývala mikrobiální degradací modifikovaných PHA materiálů s ohledem na jejich možný environmentální dopad. Na biodegradaci byla použita směsná termofilní kultura používáná v čističce odpadních vod a bakterie Delftia acidovorans. Byla testována biodegradabilita kompozitů obsahujících chlorovaný PHB a PHB fólií modifikovaných pomocí plastifikátorů. S rostoucím obsahem chlorovaného materiálu fólie vykazovaly spíše inhibiční efekt na růst biomasy obou testovaných kultur. Nejyšší míra degradace byla zaznamenána v přitomnosti bakteriální kultury u fólie obsahující 10% chlorovaného PHB (31%). Z výsledků lze konstatovat, že důležitým faktorem ovlivňující biodegradabilitu materiálů je použitá mikrobiální populace.
|
host ::
RSS.